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紫心甘薯(purple-fleshed sweet potato)是一种块根富含花青素(cyanidin)和甲基花青素(paeondin)等花青素类色素,薯肉呈紫色的特殊栽培甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.],具有独特遗传性状和经济价值。花青素属于一种花色素苷(anthocyanin),而花色素苷是广泛存在于植物中的水溶性天然色素,是某些植物叶片、果皮以及其他器官主要的呈色物质。由于花色素苷具有安全无毒、资源丰富的特点并有一定的药理作用和应用价值,近年来作为一种天然食用色素而引起广泛的重视。研究表明,植物花色素苷的合成和积累需要多个相关酶和转录因子的参与,并且还受植物内外信号因子的调控。 作为一种信号转导分子,茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MJ)在植物生长发育、代谢调节、抗病、耐逆、防御相关基因的诱导表达等方面均起着重要的作用。由于茉莉酸甲酯具有上述多效性,其作用与机制受到人们的广泛关注。近年来一些研究发现,茉莉酸甲酯可以促进郁金香、拟南芥、大豆等植物中花色素苷的合成,但茉莉酸甲酯是否影响紫心甘薯体内(尤其是块根中)花色素苷的合成尚不清楚。 本文以紫心甘薯品种(品系)‘山川紫’和‘A5’为试材,以白心甘薯品种‘禺北白’为对照,使用不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)的MJ处理三个甘薯品种(品系)的试管苗和盆栽苗,并采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析技术,研究了不同浓度MJ对紫心甘薯植株中花青素含量以及对花青素合成相关酶基因及转录因子基因表达量的影响,以寻找MJ调控紫心甘薯花青素合成的靶标。进而对靶标基因的启动子进行了克隆及序列和功能分析,以期为明确MJ调控紫心甘薯花青素合成的分子机制奠定理论和技术基础。 通过研究取得了如下主要结果和结论: 1.MJ对紫心甘薯花色素苷合成的影响具有品种和组织特异性。MJ可以促进紫心甘薯“山川紫”全株,“A5”的根、茎,白心甘薯“禺北白”的根、茎的花青素合成,抑制白心甘薯“禺北白”的叶的花青素合成。 2.以白心甘薯品种“禺北白”作对照,使用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测经MJ(1μM)处理的紫心甘薯品种“山川紫”、“A5”甘薯幼苗根部花青素合成相关酶基因及转录因子基因的表达量。结果显示,对于白心甘薯“禺北白”,bCH、IbCH、IbF3H、IbF3H、IbUF3GT、IbMYB和IbBHLH基因表达量均上调,其中IbCHS基因的表达量上调最明显,其他基因的表达量下调;对于紫心甘薯“山川紫”,IbCHS、IbF3H、IbF3H、IbANS、IbBHLH基因的表达量均上调,其中IbCHS基因的表达量上调幅度最大,IbCHI、IbDFR和IbWD40基因的表达量没有明显变化,其他基因的表达量下调;对于紫心甘薯“A5”,IbCHS、IbCHI、IbF3H、IbAN、IbUF3GT、和IbBHLH基因的表达量均上调,其中IbCHS的表达量上调最明显,而其他基因的表达量变化不明显。说明MJ(1μM)的处理对紫心甘薯花青素合成相关酶基因及转录因子基因的调控具有品种差异性,且对不同基因的调控作用也具有差异性。 3.用MJ处理导入IbCHS基因启动子驱动gus基因(PIbCHS∷gus)的转基因拟南芥幼苗,GUS活性检测结果显示,拟南芥植株中的GUS活性显著高于阴性对照和空白对照。说明MJ对IbCHS基因启动子活性有促进作用。 4.在IbF3H基因ORF的5端设计三条巢式引物,采用热不对称PCR克隆技术从紫心甘薯品种‘山川紫’根部克隆获得了长度为503 bp的花青素合成基因F3H的启动子(命名为PIbF3H)。用PlantCare软件对PIbF3H进行生物信息学分析预测的结果表明,该启动子除了具有TATA-box和CAATbox等启动子基本转录元件之外,还具有2个茉莉酸甲酯应答顺式调控元件、MYB结合元件及ABA应答元件。 5.构建了F3H基因启动子驱动gus基因(PIbF3H∷ gus)的植物表达载体(PIbF3H+PBI121)。利用根癌农杆菌介导将此表达载体瞬时转化野生型烟草叶片,GUS组织化学检测结果显示,经转化的烟草叶片呈现蓝色,而用空白农杆菌侵染或未侵染的烟草叶片则不呈现蓝色。说明F3H基因启动子可以驱动gus基因表达,具有生物学活性。此外,用该表达载体稳定转化拟南芥花序,通过筛选获得T2代阳性纯合转基因种子,转基因拟南芥T2代幼苗经GUS组织化学检测呈蓝色,而野生型拟南芥幼苗不呈现蓝色。进一步证明F3H基因启动子可以驱动gus基因表达,具有生物学活性。