流感病毒在全球范围内的广泛流行，严重威胁人类健康和社会经济。禽流感病毒H5N1在亚洲流行，并出现感染人的H5N1病毒株，预示有可能出现流感大流行病毒株。M2离子通道是抗流感药物研发的重要靶标，建立M2离子通道模型、建立快速而稳定的筛选方法是从化合物库筛选获得新型M2离子通道阻断剂药物的基础。在本研究中，首先建立了A型流感病毒H5N1的M2离子通道蛋白的稳定细胞：以A型流感病毒H5N1的M2基因片段(GenBank：AAV32638.1)为模板，经密码子优化后适合在哺乳动物细胞中高表达，人工合成野生型M2基因，命名为H5M2，并通过点突变构建金刚烷胺耐药突变型H5M2(S31N-L26I)。H5M2和H5M2(S31N-L26I)的DNA通过BamHⅠ和XbaⅠ酶切克隆于pcDNA4/TO质粒，并转染T-REx 293细胞经zeocin筛选建立稳定细胞株。稳定株细胞用1 μg/ml四环素诱导后，用Western Blot和免疫荧光证实，在T-Rex293细胞中表达的M2离子通道蛋白以单体、二聚体、四聚体形式存在，并主要表达在细胞膜上。H5M2和H5M2(S31N-L26I)的稳定株细胞的膜片钳电生理研究表明，在T-REx293细胞中表达的M2离子通道蛋白具有H+离子通道活性，金刚烷胺特异地阻断H5M2活性，IC50值为4.18μmol/L。成功建立H5M2和H5M2(S31N-L26I)的稳定细胞株为建立M2离子通道阻断剂的筛选方法奠定了基础。 本研究用pH敏感的绿色荧光蛋白(EGFP)来指示M2离子通道的活性：以p-EGFP-C1质粒为模板经PCR得到EGFP的基因片段，经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后连接到pQCXIP载体上，在H5M2和H5M2(S31N-L26I)的稳定细胞株中建立了pH敏感的绿色荧光蛋白(EGFP)稳定表达细胞。在荧光显微镜下可见EGFP在细胞内稳定表达，并对pH敏感，而且在pH5.0-6.5之间EGFP荧光强度与pH值呈线性相关。当细胞外界pH降低至6.2以下时，M2离子通道打开，H+经M2离子通道迅速进入胞内，致使细胞内pH值下降，GFP的荧光值也随之下降。本研究通过荧光测定仪synergy HT(BIO-TEK)检测M2表达和无M2表达的细胞内的荧光强度在低pH缓冲液中的变化情况。结果表明，M2表达细胞内荧光强度的下降速度明显比无M2表达细胞快，而且M2表达细胞内荧光强度的下降速度可被金刚烷胺抑制。通过分析细胞外缓冲液pH、M2表达水平、细胞数量、细胞本身的Na+/k+通道等因素对分析方法的影响，初步建立和优化了以pH敏感的EGFP为指示剂的M2离子通道阻断剂筛选法。在低pH缓冲液中，当化合物阻断M2离子通道时，H+通过M2离子通道进入细胞的速度下降，细胞内的pH值下降减缓， EGFP的荧光值下降则随之减缓。通过分析低pH缓冲液处理前后细胞内GFP荧光强度下降速度的变化，可以判断该化合物是否可以有效阻断M2离子通道，并通过GraphPad Prism分析计算化合物阻断M2离子通道的IC50值。结果表明，利用pH敏感的EGFP作为指示剂的M2离子通道筛选方法所得的金刚烷胺和金刚乙胺的IC50值分别为3.099±1.688μmol/L，和0.2588±0.1376μmol/L，与文献报道基本一致；利用该方法对本院合成的一些化合物库进行了筛选，得到一些可以阻断野生型H5M2离子通道的化合物，这些化合物的抗流感病毒活性进一步在MDCK细胞中通过病毒抑制试验进行了验证，二者结果基本一致。 总之，本研究在T-REx293细胞中建立了A型流感病毒M2离子通道模型，并利用pH敏感的绿色荧光蛋白EGFP建立了M2离子通道阻断剂的筛选方法。EGFP稳定表达于细胞内，对细胞无毒副作用，作为指示剂不需另加附加底物。用于筛选M2离子通道阻断剂化合物时操作简单易行、快速灵敏、重复性高、并具有特异性。因此，利用EGFP可以建立M2离子通道特异性阻断剂的高通量筛选方法，为研发新型抗流感药物提供了一个重要工具。