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研究背景Zika病毒(Zika virus,ZIKV)感染已成为热带和亚热带地区重大的公共卫生问题。目前,尚没有特异性抗ZIKV药,疫苗也仍处于研发阶段。早期诊断在防止ZIKV传染中具有重要的意义,在急性感染阶段,病毒编码NS1蛋白并释放入血。不同黄病毒的NS1蛋白高度保守,因此被用于鉴别诊断,NS1蛋白是用于血清学诊断ZIKV的首选蛋白。永生化细胞PER.C6由Crucell公司通过把人5型腺病毒E1区编码基因转染人的18周龄胎儿成视网膜细胞(HER)而获得。该细胞系具高效、稳定表达外源基因能力,在疫苗、重组蛋白、单克隆抗体和基因治疗等方面产品的生产得到广泛应用。然而,昂贵的转让费用也使得多数生物制药公司望而却步。目的本研究旨在建立ZIKV NS1蛋白哺乳细胞表达系统,获得高质量NS1抗原,为ZIKV血清学检测奠定基础。本研究还初步探索了永生化细胞系的建立方法,以期获得更具优势的哺乳动物细胞表达工具。方法将ZIKV NS1表达基因克隆至慢病毒表达载体中,鉴定正确的重组质粒与辅助质粒共转染HEK293T细胞,48h收集慢病毒(LV-CMV-EGFP-Zika-NSl),将LV-CMV-EGFP-Zika-NS1加入HEK 293T细胞中,挑选重组单克隆细胞。分别采用Western Blot和流式细胞分析检测连续传代的重组细胞株上清分泌NS1蛋白水平和细胞荧光率。亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析纯化效果。将纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定其血清抗体水平。构建腺病毒E1基因表达载体pUC18-PGK-E1-polyA,转染L02细胞,48 h后对转染的细胞进行1:100倍稀释,连续培养20 d,挑选与原始细胞有形态学差异的细胞灶进行Western Blot鉴定。结果酶切和测序结果表明,成功构建了 pLV-CMV-EGFP-Zika-NSl重组表达载体。包装慢病毒感染HEK 293T细胞,采用有限稀释法获得8株重组表达ZIKVNS1的单克隆HEK 293T细胞株。Western Blot结果表明其中第7号克隆表达水平最高,将其命名为HEK-293T-Zika-NSl。Western Blot及流式细胞分析结果表明重组细胞株连续传代至第35代其NS1蛋白表达水平、荧光率和荧光强度均未发生显著变化。纯化的rNSl纯度超过90%。纯化的rNS1加强免疫BALB/c小鼠后,生成高水平的抗NS1抗体。Western Blot结果表明转染pUC18-PGK-E1-polyA质粒的L02细胞表达腺病毒E1蛋白,转染的L02细胞能观察到与原始细胞有形态学差异的细胞灶。通过Western Blot鉴定目前尚未筛选到表达Ad5 E1蛋白的细胞灶。结论本研究成功构建了重组表达ZIKVNS1蛋白的HEK293T细胞系,获得高纯度的重组NS1蛋白。该抗原具有较好免疫原性,刺激小鼠机体产生高水平抗体。该研究为ZIKV血清学诊断方法的奠定基础,此外建立的重组细胞系为ZIKV NS1蛋白的生物学特性研究提供了细胞模型。通过质粒及慢病毒转染方法制备永生化细胞均尚未获得成功,需要对现有方法进行改进或探索新的细胞永生化制备方法。