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石英粉尘(简称石英)是我国最严重的职业危害因素之一,既可致矽肺,也可致癌。石英可诱导细胞周期改变,也可引起DNA双链断裂损伤(DNA double strand breaks, DSBs)。DNA损伤后,在信号分子介导下细胞周期发生阻滞,DNA损伤修复蛋白被激活进行DNA损伤修复。DNA依赖性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase, DNA-PK)是DSBs的传感器之一,识别受损伤的DNA,磷酸化组蛋白H2AX,参与DSBs的非同源末端连接。DNA-PK由调节亚单位Ku和催化亚单位(DNA-PK catalytic subunit, DNA-PKcs)组成,Ku是Ku70与Ku80蛋白通过非共价键紧密结合形成的异二聚体结构。以往研究表明,DNA-PK作为蛋白激酶可将多种重要的功能蛋白底物,如Akt、JNK、AP-1、p53等磷酸化,激活DNA损伤信号转导通路,促进修复相关因子的转录、引起细胞周期阻滞或诱导细胞凋亡。本课题组前期研究发现,Akt/JNK/AP-1信号通路可调节CyclinD1和CDK4表达,参与石英诱导的细胞周期S期阻滞；DNA-PKcs具有DSBs传感器功能,通过DNA-PKcs/JNK信号通路,促进石英致DSBs的修复。然而,Ku在石英致DSBs修复的DNA-PK/JNK信号通路中的作用仍不清楚。其次,DNA-PK与磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)有相同的结构域,均与MAPKs及细胞周期有关,两者在石英致DSBs的修复通路中作用的异同仍有待研究。针对以上问题,本研究以人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblasts, HELF)为实验模型,采用RNAi、显性失活突变体以及化学抑制剂等研究手段,将我室以往的MAPKs通路研究向上溯源至传感器DNA-PK的调节亚单位Ku,向下追踪到DSBs损伤及修复,重点研究Ku80在石英致DSBs修复及细胞周期改变中的作用,以及Ku80与DNA-PK/JNK通路中信号分子的上下游关系。其次,探讨PI3K在石英致DSBs修复中的作用以及对DNA-PK的影响。采用Ku80的siRNA及阴性对照质粒稳定转染HELF;中性彗星实验和／或yH2AX识别抗体技术检测石英致DSBs损伤程度；免疫印迹法测定蛋白的表达及其磷酸化水平；免疫荧光技术检测yH2AX焦点在细胞内的定位及其水平；流式细胞术检测细胞周期。结果如下：1成功建立了Ku80 siRNA质粒及阴性对照质粒稳定转染HELF的细胞系。2抑制Ku80表达,石英诱导的γH2AX水平的升高被抑制,即H2AX磷酸化是Ku80依赖性的；DSBs修复能力降低；石英诱导的Akt、JNK、AP-1 (c-Jun)磷酸化水平增加受抑制。3抑制Ku80表达,石英诱导的G1期细胞百分比进一步减少,S期细胞百分比进一步增加；E2F1蛋白表达及pRb-Ser780水平进一步增加；Cyclin D1、CDK4、CyclinE、CDK2、p53、p53(serl5)、p21表达及磷酸化水平增加受抑制。4抑制PI3K活性,石英诱导的Ku70、Ku80和γH2AX表达及磷酸化水平升高受抑制,对DNA-PKcs表达无影响；DSBs修复能力降低。根据以上结果,本研究结论如下：1 Ku80是DNA-PK发挥DSBs感受器功能的必要组成成分,通过调节DNA-PK/JNK信号通路促进石英致DSBs的修复。2 Ku80通过DNA-PK/JNK信号通路正性调控CyclinD1、CDK4、CyclinE、CDK2表达水平；通过DNA-PK/p53信号通路正性调控p21的表达,负性调控E2F1表达及pRb-Ser780磷酸化水平。Ku80抑制石英诱导的G1期细胞比例减少及S期细胞比例增加。3 PI3K通过调节Ku70、Ku80的表达,影响DNA-PK全酶的活性,促进石英致DSBs的修复。综上所述,石英诱导的细胞周期改变是各信号分子综合调控的结果。Ku80参与石英诱导的细胞周期改变,引起G1／S期阻滞,为DSBs修复赢得时间,并通过调节DNA-PK/Akt/JNK/AP-1信号通路,促进石英致DSBs的修复。本研究探讨了Ku80在石英致DSBs修复的DNA-PK/JNK信号转导通路中的作用,所得结果加深了对石英致病分子机制的理解,为深入研究石英的致病机理提供了线索。