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细胞凋亡是多细胞生物体正常的生理现象,对于生理和病理过程具有重要的意义。近年来,随着家蚕研究如火如荼地进行,尤其关于家蚕变态期引发的细胞凋亡的研究具有重要的意义。本实验在家蚕中克隆了Caspase-8的同源体BmDredd,分析了其结构特征,并初步研究了该基因功能,为进一步解析家蚕细胞凋亡机制奠定了基础。1.家蚕凋亡基因BmDredd的克隆与序列分析我们成功克隆了家蚕BmDredd,全长1960bp,其ORF长1632bp(251-1882)编码543个氨基酸,预测蛋白的分子量大小为63.4kDa,等电点为6.22；基因组序列分析结果显示BmDredd基因共有1个外显子,位于10号染色体；通过结构域预测,BmDredd具有Caspase家族保守的特异的五肽结构域(QACRG);应用Mega4.0软件构建系统进化发生树,表明家蚕BmDredd与黑腹果蝇,埃及伊蚊的进化距离较近,推测BmDredd可能是Caspase-8同源物,可能具备促凋亡功能。2. BmDredd基因的表达和酶活性分析我们成功克隆了BmDredd/pcoldⅡ原核载体(制备抗体),BmDredd/pIZ-DsRed真核载体和BmDredd/pIZ-v5/His干涉载体。当BmDredd表达量达到一定浓度时,随后会发生自我剪切,活化为有一定功能的蛋白结构。酶活性检测结果初步验证BmDredd是Caspase-8同源物。在正常细胞中,BmDredd蛋白是以酶原形式存在,而当Emodin诱导家蚕BmN-SWU1细胞发生凋亡时,BmDredd前体蛋白被活化行使凋亡功能,使得Caspase-8酶活性升高。当凋亡信号刺激靶细胞,可以激活细胞内源性的BmDredd酶原,首先大小亚基组成异二聚体,然后两个二聚体形成同源四聚体(P20/P10)2,最后激活下游的caspase家族成员,引起细胞凋亡。3. BmDredd基因的功能初探(1)家蚕细胞死亡受体途径模式的建立我们通过Emodin处理家蚕BmN-SWU1细胞,构建了家蚕细胞死亡受体途径模式。第一,Emodin可以诱导家蚕BmN-SWU1细胞产生凋亡小体和DNA片段化,发生凋亡,具有时间剂量依赖性。第二,Emodin可以抑制家蚕BmN-SWU1细胞的生长,促进家蚕BmN-SWU1细胞的凋亡,具有时间剂量依赖性。第三,Emodin可以诱导家蚕BmN-SWU1细胞的Caspase-3/7,Caspase-8,Caspase-9酶活活性升高,且Caspase-8酶活性升高明显。综上所述,Emodin通过死亡受体途径诱导家蚕细胞凋亡,成功构建了家蚕细胞死亡受体途径模式。(2)基因过表达对家蚕细胞凋亡的影响我们检测了家蚕BmDredd过表达对家蚕BmN-SWU1细胞的影响。结果表明：BmDredd可以抑制家蚕BmN-SWU1细胞的生长,促进家蚕BmN-SWU1细胞的凋亡：BmDredd可以诱导家蚕BmN-SWUl细胞凋亡,具有Caspase-3/7,Caspase-8, Caspase-9酶活性,且主要具有Caspase-8酶活性；发现BmDredd与死亡受体抗体TNFSF13[42]可以相互作用。综上所述,初步验证BmDredd基因促进Emodin通过死亡受体途径诱导家蚕BmN-SWU1细胞凋亡(3)凋亡诱导下基因过表达和干涉对细胞凋亡的影响通过细胞流式检测结果表明,BmDredd基因过表达细胞凋亡率升高,而干涉BmDredd基因后细胞凋亡率显著性降低,表明BmDredd基因可以促进家蚕BmN-SWU1细胞凋亡。通过实时定量结果显示,BmDredd基因过表达后定量结果升高,但是干涉BmDredd基因后其表达量显著性降低,BmDredd基因过表达具有促进家蚕BmN-SWU1细胞凋亡的作用。这与之前的细胞酶活、免疫荧光、流式检测的结果是一致的。综上所述,BmDredd基因确实参与死亡受体途径,行使Caspase-8的同源基因的功能,促进家蚕BmN-SWU1细胞的凋亡。