亚硝酸盐是细菌硝化作用和生态系统中脱氮作用过程的中间产物。通常情况下，生态系统中细菌硝化作用和反硝化作用处于一个动态平衡状态。然而，随着水产动物集约化养殖的发展，水质污染加剧，使环境中亚硝酸盐的含量不断上升，成为水产养殖中诱发爆发性疾病的重要环境因子。以往由于研究技术限制等原因，关于亚硝酸盐对水产动物毒性作用的研究多数停留在半致死浓度，以及对生理生化代谢和免疫功能的影响等方面，其具体应激作用机制仍有待深入研究。本研究一方面应用流式细胞术分析凡纳滨对虾血细胞对亚硝酸盐应激的细胞响应，另一方面应用近年发展起来的RNA-Seq技术，对亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的转录组进行了全面解析，并构建了应激前后的数字基因表达谱，筛选了应激前后的差异表达基因，结合实时定量PCR技术分析了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的分子响应，初步探讨亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的反应机制。具体研究结果如下:　　(1)研究亚硝酸盐对血细胞的毒性影响。结果显示，经亚硝酸盐应激12，24，48和72 h后，血细胞的一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)含量与对照组相比都有显著升高，非特异性酯酶活性在应激的24，48和72 h显著下降，在应激的48和72 h，血细胞的凋亡率与对照组相比有显著升高。这些结果表明亚硝酸盐应激诱导对虾血细胞产生了过量的NO和ROS，造成氧化胁迫作用，诱导血细胞发生凋亡，从而导致对虾免疫功能下降。　　(2)研究亚硝酸盐对血细胞基因表达的影响。结果显示，p53和cathepsin B的表达水平在应激48和72 h后显著升高;caspase-3和CAT的表达量在应激24和48 h后显著升高;TRx在应激48 h后表达水平达到最高，并与对照组有显著性差异;MnSOD的表达水平在应激8和48 h后与对照组相比显著升高;GPx的表达表现出先升高后降低的趋势，在应激8和12h后与对照组有显著性差异。Hsp70的表达量在应激后的8和72 h显著升高。这些结果表明亚硝酸盐应激下，抗氧化酶基因的表达会被诱导上调进行抗应激防御;另一方面，凋亡相关基因的表达也会被诱导上调，从而诱导血细胞发生凋亡。这些结果与细胞水平的研究结果是一致的。　　(3)亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的转录组学分析。利用Illumina测序技术构建了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的转录组文库，经过过滤和组装，获得了42，336条Unigenes，平均长度为561 bp，N50为736 bp。利用BLAST和BLAST2GO软件对这些从头组装的Unigenes进行注释。用NCBI蛋白质数据库(Nr)，非冗余核苷酸数据库(Nt)，基因本体论(GO)，直系同源基因簇(COG)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库做参考，共注释了23，532条Unigenes。　　(4)亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的数字基因表达谱分析。选取应激后0和48 h的凡纳滨对虾血淋巴构建数字表达谱文库，以错误发现率(FalseDiscovery Rate，FDR)≤0.001和|log2 PRKM(48 h)/PRKM(0 h)|≥1为筛选条件，发现有1922个差异表达的基因，这些差异性表达基因对亚硝酸盐应激后的反应是一个整体调控网络。对这些差异表达基因进行GO和KEGG综合分析发现，亚硝酸盐应激影响了凡纳滨对虾的免疫防御、外源性物质降解和代谢以及DNA复制和修复。说明亚硝酸盐应激显著影响了凡纳滨对虾的免疫系统以及外源性物质的降解和解毒途径，同时，机体启动了DNA修复系统对亚硝酸盐应激造成的DNA损伤进行修复，当应激持续、过多的活性氧不能及时清除，机体无法修复由此导致的DNA损伤时，就发生了细胞凋亡。QPCR验证发现腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP binding cassette transporter, ABCtransporter)、蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）、谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TGase)、几丁质酶(chitinase)、凋亡抑制因子（Inhibitor of Apoptosis Protein，IAP）和细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)等基因的表达量被显著诱导，说明这些基因通过上调表达量参与了环境毒物亚硝酸盐的应激反应，为后续研究如何提高对虾抗亚硝酸盐胁迫的能力提供了理论基础。　　综合以上研究结果，初步构建了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的细胞和分子响应的调控网络。研究成果进一步扩展了甲壳动物的基因库，为探索新基因的序列和功能提供了有效的信息，为深入研究亚硝酸盐对凡纳滨对虾毒性效应的分子机制以及对虾抗胁迫防御机理奠定了基础。对于提高对虾抗环境胁迫和抗病原感染的能力、降低亚硝酸盐的危害，促进虾类的健康安全养殖具有重要的现实意义。