根据GenBank上已经公布的马链球菌兽疫亚种重要保护性抗原类M蛋白(M-like protein)的编码基因Szp的基因序列,设计出一对引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株的全基因组DNA为模板,通过多聚酶链式反应扩增出目的基因并定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,通过PCR鉴定和重组质粒双酶切鉴定之后,确认重组质粒构建成功。再将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,对阳性菌落进行增菌培养,并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖(IPTG)诱导其在低温下进行表达。经SDS-PAGE鉴定,表明类M蛋白获得了良好的表达,且以可溶性蛋白形式存在于上清中,蛋白分子量与推导值一致。Western-blot免疫印迹反应显示,所得目的蛋白可被猪源ATCC35246株康复血清识别,表明其具有良好的免疫原性。随后用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化蛋白后,通过Bradford蛋白定量法绘制了测定蛋白浓度的标准曲线,并运用统计学知识,建立了回归方程,对获得的类M蛋白进行定量分析,测定了较为精确的类M蛋白的浓度。在此基础上,用类M蛋白作为包被抗原,采用方阵滴定法,确定了抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度,并通过一系列的优化试验,确定了最佳反应试剂和操作规程,并组建了间接ELISA反应试剂盒,随后通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验和保存期试验等对该试剂盒的敏感性、特异性和长期应用与保存条件进行了检验,并通过对实验室保存的40份标准阴性血清进行了测定,确定了平均值,标准偏差,根据经验公式确定了阴阳性临界值。从而为后续的流行病学调查奠定了基础。本试验对实验室保存的猪血清400份,实验室保存的血清主要来自河南、上海、山东、安徽地区,采集自南京地区部分猪场的80份血清、肉联厂的猪血清100份,用已经建立的ELISA操作规程对其进行了检测；对常用试验动物小鼠、家兔在试验前采集其血清各50份进行检测,以确定南京和扬州地区部分试验动物感染马链球菌兽疫亚种的情况；对南京地区部分养牛场的血清50份进行了检测,以确定大动物感染马链球菌兽疫亚种的情况。结果显示,调查中的各省血清阳性率从16%-33.3%不等,安徽和河南的小型猪场血清阳性率偏高,江苏、山东和上海地区的猪场血清阳性率偏低,初步推测是由于规模化的养殖管理促进了马链球菌兽疫亚种的防治；健康小鼠的血清抗体阳性率为84%,健康家兔的血清抗体阳性率为78%；牛的血清抗体阳性率为0。