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实验背景:卵巢恶性肿瘤是妇科最常见的恶性肿瘤之一,由于其发病隐匿、缺少有效的早期筛查手段,大部分患者初诊时即为卵巢癌晚期,故其死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。手术治疗、术后以铂类、紫杉醇为基础的联合化疗是常规的一线治疗方案,然而,上述治疗后,患者的临床结局并不理想,5年复发率和总生存期并未得到明显改善,这与术后患者体内的残余病灶以及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性密切相关。随着多学科协同发展,肿瘤免疫治疗学逐渐成为临床医学的关注重点,其中,过继性细胞免疫治疗更被认为是卵巢癌晚期免疫力较低患者的一种理想免疫治疗方式。它能够特异性地清除患者体内肿瘤微小残留病变,预防肿瘤复发、逆转肿瘤细胞化疗耐药,改善卵巢癌患者的临床结局。为探讨特异性CTL对卵巢癌杀伤作用及其机制,我团队在前期研究中,将含有Cp G基序的寡聚核苷酸序列(Cp G Oligodeoxynucleotide,Cp G ODN)和人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,Rg1)联合作为免疫佐剂,与HER2/neu抗原肽结合建立特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的体外大规模培养体系,并通过体外实验证实特异性CTL具有高度抗原特异性,在体外对卵巢癌细胞SKOV-3有显著的杀伤、抑制作用,能够破坏卵巢癌细胞SKOV-3正常的细胞周期,使之停滞在S期,同时亦可以调节多种凋亡基因,诱导卵巢癌细胞SKOV-3凋亡。并且,特异性CTL可以通过影响卵巢癌细胞SKOV-3PI3K/Akt通路相关蛋白的表达,抑制PI3K/Akt通路相关作用,从而发挥抗卵巢癌、逆转化疗耐药的作用。实验目的:研究特异性CTL对卵巢癌细胞SKOV-3的迁移和侵袭能力的影响,验证特异性CTL对荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞的杀伤、抑制作用及其对荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞凋亡、化疗耐药相关信号通路的影响。实验方法:第1部分:特异性CTL对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响。设立特异性CTL组(由健康志愿者外周血获得的PBMC经CpG ODN、人参皂苷Rg1、HER2/neu抗原肽刺激、诱导获得)、PBMC组(未刺激的健康志愿者外周血单个核淋巴细胞)、空白对照组,通过划痕实验,分别将特异性CTL、PBMC与贴壁卵巢癌细胞SKOV-3共培养,测定24h、48h划痕愈合程度来检测特异性CTL对SKOV-3细胞迁移能力的影响;通过Tranwell小室实验,检测特异性CTL、PBMC与SKOV-3细胞共培养24小时后SKOV-3细胞透过聚碳酸酯膜的数量,研究特异性CTL对SKOV-3细胞侵袭能力的影响。第2部分:特异性CTL对裸鼠体内卵巢癌抑制作用的研究。建立裸鼠皮下卵巢癌模型,将其随机分为三组(特异性CTL组、PBMC组、空白对照组),并通过局部注射的方式给予相应治疗,连续7天治疗后,于第8天处死裸鼠,测量皮下瘤模型裸鼠皮下瘤的体积并称重,计算肿瘤抑制率,计算T/C值,检测治疗有效率。与此同时,建立裸鼠腹腔卵巢癌模型,并将其随机分为三组(特异性CTL组、PBMC组、空白对照组),并通过腹腔注射的方式给予相应治疗,连续治疗7天后,于第8天处死裸鼠并进行剖检,收集腹腔种植瘤,称重,计算肿瘤抑制率。第3部分:特异性CTL逆转上皮性卵巢癌耐药相关机制的研究。收集上述各组皮下瘤及腹腔瘤,应用免疫组化染色方法对PI3K蛋白、Akt蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白进行半定量检测,对荷瘤裸鼠体内特异性CTL对卵巢癌细胞对化疗耐药相关通路PI3K/Akt以及凋亡相关通路Bcl-2、Caspase-3的影响进行研究。实验结果:第1部分:1划痕实验结果显示,特异性CTL组SKOV-3细胞在24小时及48小时的迁移距离均明显小于PBMC组及空白对照组。2Transwell小室实验结果显示,特异性CTL组SKOV-3细胞在24小时时透过聚碳酸酯膜的数量明显小于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),组间差异有统计学意义。第2部分:1特异性CTL组皮下瘤体积明显小于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),组间差异有统计学意义。根据实验结果,T/C=29.80%,小于40%,治疗有效。2特异性CTL组皮下瘤重量明显小于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),与空白对照组对比,肿瘤抑制率IR=54.23%。3特异性CTL组腹腔瘤重量明显小于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),与空白对照组对比,肿瘤抑制率IR=70.61%。第3部分:1特异性CTL组免疫组织化学染色PI3K蛋白、Akt蛋白的表达均低于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),组间差异有统计学意义。2特异性CTL组、PBMC组、空白对照组免疫组织化学染色结果显示Bcl-2蛋白的表达均呈弱阳性,组间差异无统计学意义。3特异性CTL组卵巢癌细胞免疫组织化学染色Caspase-3蛋白表达高于PBMC组(p<0.05)及空白对照组(p<0.05),组间差异有统计学意义。结论:由CpG ODN、人参皂苷Rg1、HER2/neu抗原肽刺激诱导获得的特异性CTL能够抑制体外卵巢癌细胞的迁移和侵袭,对荷瘤裸鼠体内的卵巢癌细胞亦具有一定的抑制作用,且其可能通过影响荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞PI3K/Akt通路、Caspase-3蛋白相关通路的作用而促进肿瘤凋亡、逆转化疗耐药,对Bcl-2相关凋亡蛋白影响不大。