背景:结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,目前在全球范围内的发病率位于第四位,而死亡率位于第三位,仅次于肺癌和乳腺癌,严重威胁着人类的健康。大部分结直肠癌患者在就诊时就已经处于晚期阶段,由于周围组织的浸润和远处转移的发生,这些患者的预后往往很差。即使是用手术手段切除肿瘤后,由于缺乏有效的治疗手段,术后复发率很高。在结直肠癌的发病机制中,除了遗传学、表观遗传学方面的变化外,肿瘤细胞的代谢异常也是其中的因素之一。作为氨基酸代谢最重要的组成部分,谷氨酰胺代谢在很多肿瘤中发挥重要作用,但是它在结直肠癌发生中的作用以及谷氨酰胺代谢的调控机制尚未明确。因此,阐明结直肠癌的发病机制对于治疗和预防结直肠癌具有重要的科学价值。目的:已有研究证实谷氨酰胺代谢在多种肿瘤中具有重要的作用,但是在结直肠癌中的作用及其分子调控机制尚未明确。我们希望通过多种体内和体外实验来明确谷氨酰胺代谢对于结直肠癌的重要作用以及其具体的调控机制。具体来说,我们想研究谷氨酰胺代谢的限速酶谷氨酰胺酶1(GLS1)在结直肠癌中的作用,阐明谷氨酰胺酶1在结直肠癌中的调控机制,以及靶向抑制谷氨酰胺酶1是否对于结直肠癌的发生发展具有一定的预防和治疗作用。方法:首先我们在结直肠癌细胞中撤除谷氨酰胺,检测谷氨酰胺对于结直肠癌细胞的增殖和代谢方面的影响。接下来通过Western Blot和免疫组化的方法检测谷氨酰胺酶1在结直肠癌中的表达情况,利用GLS1特异性的siRNA敲除GLS1后,检测细胞增殖和代谢方面的变化。然后我们研究Wnt信号通路(过表达APC或者β-catenin siRNA前后)对于GLS1表达的影响,通过qPCR筛选β-cateninsiRNA前后发生变化的miRNA,最终选定miR-137作为进一步研究的对象。接下来我们用ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)和BGS、MedIP等甲基化的方法研究热休克蛋白转录因子HSF1调控miR-137的具体机制。我们进一步运用western Blot、免疫共沉淀(Co-IP)和RNA-IP等方法研究Wnt信号通路(β-cateninsiRNA前后)对于HSF1的调控机制。最后我们在APCmin/+和AOM/DSS等结直肠癌老鼠模型当中应用谷氨酰胺酶的抑制剂compound968,验证体内靶向治疗谷氨酰胺酶对结直肠癌肿瘤发生发展的影响。结果:在结直肠癌细胞中撤除谷氨酰胺会抑制肿瘤细胞的生长,并且抑制a-酮戊二酸、ATP等三羧酸循环中间代谢产物的形成。同时诱导产生保护性的细胞自噬,如果联合自噬抑制剂氯喹(CQ)或(和)左旋门冬酰胺酶(L-ASP)可以增强肿瘤细胞的杀伤效果。GLS1在结直肠癌细胞系和肿瘤组织中存在高表达的现象,如果敲除GLS1,结直肠癌细胞的增殖和代谢也会受到抑制。机制上,我们发现抑制Wnt信号通路(过表达APC或者敲除β-catenin)可以抑制GLS1的蛋白表达水平,而不是mRNA水平。从一系列变化的miRNA当中,我们发现miR-137可以直接抑制GLS1蛋白翻译过程,它在结直肠癌组织和细胞系中低表达。我们进一步发现热休克转录因子HSF1可以通过结合DNA甲基化酶3a(DNMT3a)来促进miR-137启动子区域的甲基化程度,进而抑制miR-137的表达。而Wnt信号通路(β-catenin)通过与RNA结合蛋白HuR相互结合,从而促进HSF1 mRNA的翻译效率。最后,GLS1在APCmin/+和AOM/DSS老鼠模型当中处于高表达的状态,应用抑制剂968靶向GLS1联合自噬抑制剂氯喹(CQ)和左旋门冬酰胺酶(L-ASP)可以抑制结直肠癌的形成。结论:GLS1对于结直肠癌的发生发展具有重要的促进作用,它的表达水平是受Wnt/APC-β-catenin-HSF1-miR-137-GLS1轴的调控,抑制谷氨酰胺代谢联合自噬抑制剂氯喹(CQ)和左旋门冬酰胺酶(L-ASP)可以抑制结直肠癌的发生发展。并且这有利于我们更好的了解结直肠癌肿瘤代谢,为我们提供了治疗和预防结直肠癌(或者其他肿瘤)的新方向。创新点:1.在结直肠癌中抑制谷氨酰胺代谢,引起代偿性的保护性自噬发生,联合自噬抑制剂氯喹(CQ)和左旋门冬酰胺酶(L-ASP)可以进一步杀伤肿瘤细胞。2.GLS1在结直肠肿瘤发生发展中的具有重要的促进作用,它的表达受Wnt信号通路的调控。3.GLS1是miR-137下游的一个直接靶基因。4.HSF1通过与DNMT3a相互作用,促进miR-137的启动子区域发生甲基化。5.β-catenin与RNA结合蛋白HuR相互作用,上调HSF1mRNA的翻译效率。6.GLS1在APCmin/+和AOM/DSS老鼠中高表达,联合应用GLS1的抑制剂compound 968、CQ和L-ASP可以抑制结直肠癌的形成。