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蛋白激酶是细胞内最大的蛋白家族之一,参与细胞生长、分裂和凋亡等多种生理过程。调节机制失控的蛋白激酶引发多种癌症的发生,目前已成为重要的药物研究靶点,作为癌症治疗手段的蛋白激酶的高活性高选择性抑制剂的研发势在必行。运用药物设计与分子模拟方法,对蛋白激酶结构与功能进行模拟研究,在充分了解靶标活性口袋三维结构的基础上,对小分子抑制剂提出合理的结构修饰,以期得到高活性高选择性的药物先导化合物。本论文围绕蛋白激酶CK2(Protein kinase CK2)与小分子复合物的结构与功能及肝糖合成酶激酶GSK3β海绵类代谢物抑制剂衍生物的设计进行了理论计算方面的研究。
1.位于CK2α活性口袋内部的疏水性残基Va166,Met163及Ile174,因具有较大的支链,其活性口袋与其它激酶如CDK2(相应位置为支链较小的残基Ala)相比具有较小的活性口袋,对一些小分子抑制剂表现出良好的选择性。同时,该三个残基的单个突变或者组合突变降低小分子与CK2的结合能力。为了探究Va166突变为Ala对CK2α-Emodin复合物结构的影响,对野生及V66A两个体系进行分子动力学模拟研究。结果表明维持野生复合物稳定存在的主要因素包括残基Leu45,Va153,Va166,Ile95,Phe119,Met163和Ile174的支链形成的疏水腔,与镶嵌在其中的Emodin的芳香环之间较强的疏水作用,以及Emodin与Lys68,保守性水分子之间的静电作用。而在V66A突变体复合物中,CK2α的构象及Emodin的位置指向均发生了变化。其中,CK2α的结构变化分布在偏移的C-loop和张开的G-loop,由于支链的减少,使得原有的疏水性残基无法紧密堆积,柔性的C-loop与G-loop之间通过蛋白内部的作用网络使得蛋白呈现张开的构象。因此Emodin与CK2α之间有序的疏水作用及静电作用均遭到了破坏。另外MM_PBSA计算从结合能的角度揭示了突变体复合物与野生型相比较差的稳定性,并且发现前者的范德华作用能与野生型相比明显不利于Emodin的结合,而且突变体的的静电作用能和结合能均明显高于野生型,这与模拟结果中静电作用的减少相一致。同时通过基于残基的能量分解,识别出的关键性残基与动力学模拟的结果一致,并且突变体复合物中的关键性残基的能量贡献均不利于复合物的稳定存在,这也与动力学模拟结果得出的这些残基与Emodin的作用减少构是一致的。
2.8-dibromo-7-hydroxy-4-methylchromen-2-one(DBC)类化合物对CK2α具有微摩尔级的抑制活性,生物活性与取代基的性质及位置有着密切的关系,因此对该类化合物进行结构改造使其活性得以提高有着重要意义。运用低能构象搜索及分子对接方法得到两组构象,对该类化合物进行三维定量构效关系(3D-QSAR)研究。两种方法均得到良好的模型,并能很好地解释实验结果,可指导新的DBC类化合物的设计。结果表明尽管两种方法所得到某些化合物取代基的构象有些差别,但由于这些取代基指向结合口袋的外部,提供给该取代基构象多样化的空间,并且该取代基对活性几乎没有影响,因此对CoMFA以及CoMSIA模型没有太大的影响,根据CoMSIA模型的三维等值线图及该蛋白活性口袋周围残基的性质,可以得出以下结论:化合物的4号位处于残基Va145,Ile66,Val116以及Met163组成的疏水性空腔,因此引入体积较大且疏水性的取代基有利于活性的提高。两个环与芳香性残基Phe113的苯环形成π-π共轭作用,最好引入供电性的基团,以便增加环上的电子密度。8号位附近是带有正电荷的Lys68,引入氢键受体如羰基则有利于活性的提高。
3.Hymenialdisine(HD)和Dibromocatharelline(DT)是海绵代谢产物的主要成分,前者对高度同源的GSK3β和CDK2及CDK5均具有良好的抑制活性,而后者选择性地对GSK3β具有3000nM的抑制活性。运用FlexX对接手段及分子动力学模拟方法来解释DT选择性抑制GSK3β的作用机理,并在此基础上提出结构修饰。结果表明HD与CDK5和GSK3β的结合模式类似,这与实验测的具有相差不大的抑制效果是一致的。运用同样的方法得到GSK3β-DT复合物,但是却无法将DT对接到CDK5的活性口袋中。将其结合口袋与CDK5叠合发现,CDK5体积较小的结合口袋及密集的静电作用网络无法容纳DT的胍基支链,因此DT对CDK5几乎没有抑制活性。分子动力学模拟方法揭示了DT与GSK3β独特的结合模式:A环的N1原子与Val135的羰基氧原子形成氢键,A环的羰基O原子与Arg141的支链形成了较弱的氢键,胍基上的N3原子与Gln185羰基O原子形成稳定的氢键,及N4原子与Asn186的支链形成盐桥作用。除此之外,溴原子与Leu132形成疏水作用,A、B、C三个环也与周围Leu132,Leu188,Val110和Cys199残基形成疏水作用。基于该独特的作用模式以及D环附近是GSK3β的特异性疏水性残基Cys199,该残基对应于CDKs为Ala,建议在该环上引入卤素甲基取代基,可以与特异性残基Cys199形成共价键作用,保持其选择性的基础上进一步提高活性。
以上研究阐述了蛋白激酶与小分子抑制剂突变体复合物的结构及功能特征,为研究更多的小分子抑制剂提供了借鉴。同时通过阐述CK2α和GSK3β活性口袋的特征,提出了DT及DBC类化合物结构修饰规律,对基于结构的药物设计提供有益的信息。