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目的:非小细胞肺癌(NSCLC)是一种发病率和死亡率极高的恶性肿瘤。基于肿瘤组织分子分型的靶向治疗是NSCLC治疗的常用手段,但患者肿瘤组织常常难以获得,无法进行基因检测。本研究用血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)代替肿瘤组织DNA进行基因突变检测,建立了一种简单、快速、无创的检测新方法,为NSCLC患者个体化靶向治疗方案的确定提供手段。方法:(1)通过建立外标评价法,来评价ctDNA提取试剂盒提取效率,离心条件对ctDNA提取的影响,ctDNA的冻融稳定性、放置稳定性和长期稳定性,进而建立标准的ctDNA样本处理流程;(2)通过将单管巢式PCR与肽核酸(PNA)探针钳制反应相结合,建立了基于双重PNA钳制反应的新型ctDNA检测技术,并通过灵敏度、特异性、准确性等进行性能评价;(3)利用已建立的新型ctDNA检测技术对132例非小细胞肺癌血浆和对应组织样本中的4个表皮生长因子受体热点突变位点进行检测,来评价血浆和肿瘤组织的一致性。结果:(1)大体积(≥2 mL)血浆ctDNA提取时,选择不同试剂盒提取效率会有差别(Simgen Circulating Nucleic Acid Kit>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit>Magen HiPure Blood DNA Mini Kit);需用来做ctDNA检测的全血样本不宜冻融,且全血在4℃放置时间不宜超过24 h,在室温放置时间不宜超过12 h。血浆中的ctDNA,3次以内冻融稳定性良好,冻存(-20℃)或冷藏(4℃)放置24 h稳定性良好,室温放置4 h稳定性良好,-80℃长期放置时,会随着时间延长,出现部分降解的现象。提取后的ctDNA,3次以内冻融稳定性良好,冻存(-20℃)或冷藏(4℃)放置48 h稳定性良好,室温放置12h稳定性良好,-80℃长期放置时,依然会随着时间延长,出现部分降解的现象。(2)基于双重PNA钳制反应的新型ctDNA检测技术(LNA-dPNA PCR clamp)经表征,扩增灵敏度为100拷贝/反应,比ddPCR提高了10倍;线性范围为100～106-107,比ddPCR宽2～3个数量级;突变检测LOD为0.01%～0.1%,与ddPCR具有相似的LOD;且LNA-dPNA PCR clamp对L858R,EGFRExon 19 deletion,EGFRT790M,EGFRC797S四个位点均能实现高灵敏检测,方法具有通用性;此外,LNA-dPNAPCR clamp还能实现对ctDNA的绝对定量,定量结果与ddPCR定量结果相似(r=0.9782,p<0.0001)。进一步比较成本和耗时发现,LNA-dPNAPCR clamp成本比ddPCR降低了29.0%(39.68美元vs.56.04美元),耗时降低了31.3%(2.75 h vs.4.0 h)。(3)利用 LNA-dPNAPCR clamp 和 ddPCR 对 132 例 NSCLC 患者的血浆 ctDNA和对应的肿瘤组织进行检测,比较患者血浆ctDNA和肿瘤组织中EGFR L858R位点突变检测结果一致性。结果显示,两种方法在评价血浆ctDNA代替肿瘤组织的灵敏度为19.6%和21.7%,特异性为94.2%和91.9%。总一致性为68.2%和67.4%。进一步分析发现,血浆ctDNA和肿瘤组织的一致性在早期NSCLC(I期)中较低,在中晚期(Ⅱ-Ⅳ期)中较高。因此,我们推荐:中晚期NSCLC患者选择用血浆ctDNA代替肿瘤组织进行基因突变检测,效果更好。在此基础上,我们通过案例分析对血浆ctDNA检测结果与TKI疗效的相关性进行了初步的评估,初步证明了基于血浆ctDNA检测结果的靶向药物个体化治疗,可让NSCLC患者从TKI治疗中获益。结论:本研究为血浆中极微量血浆ctDNA基因突变检测提供了一种高灵敏、高特异、简便快速、无污染和低成本的新型检测技术,为NSCLC患者靶向用药个体化治疗方案提供了新手段。