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肺炎克雷伯菌(KPn)是社区获得性感染和医院感染中最常见的病原菌之一。及早使用有效抗生素是治愈的关键。然而,随着抗菌药物的广泛应用,KPn对喹诺酮的耐药性包括对环丙沙星(CIP)的耐药率逐年上升。在临床上,黄连素(Ber)主要用来治疗感染性腹泻等相关疾病,但单用黄连素或协同抗生素对抗其他细菌感染尤其是肺炎克雷伯菌的的报道很少,故本研究探讨黄连素与环丙沙星联用是否能增加抗菌作用,根据研究结果制定针对性抗感染治疗合理用药方案,指导临床用药。 目的： 1.建立稳定传代的高度耐药的KPn模型,了解环丙沙星在体外对KPn的耐药诱导作用; 2.研究黄连素与环丙沙星联用能否增加环丙沙星对KPn的抗菌作用; 3.探讨两药联用对敏感菌和耐药菌的效果差异; 4.检测不同浓度的黄连素与两药联合抗菌效果的关系。 方法： 1.从临床收集的KPn菌株中按要求筛选出敏感株17株和临床耐药株9株。 2.用环丙沙星逐浓度梯度体外人工诱导出高度耐药的KPn菌株,并采用耐药稳定性传代试验筛选出稳定的高度耐药菌株。并参照2011年CLSI纸片法标准,采用K-B纸片扩散法对体外人工诱导出的高度耐药菌株进行药敏实验。 3.实验分组:KPn分为敏感株组(17株)、临床耐药株组(9株)和诱导耐药株组(14株)。 4.采用琼脂二倍稀释法,测定加入黄连素前后KPn菌株对环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC)变化情况,并分别计算出3组菌株对环丙沙星的MIC下降率。 5.分别设置空白对照、单用环丙沙星、单用100μg/ml黄连素、500μg/ml黄连素、100μg/ml黄连素+环丙沙星、500μg/ml黄连素+环丙沙星6组,选取上一步方法中两药联用下有效的阳性株12株(敏感株6,临床耐药株2株,诱导耐药株4株),用分光光度计分别测定0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h细菌的OD600值。以培养时间为X轴,OD600值为Y轴,取平均值绘制出不同菌株的生长曲线。 结果： 1.17株KPn敏感株在含128μg/ml环丙沙星平板上无一存活。有3株KPn菌株在诱导过程中死亡。其余14株KPn菌株均诱导成功,对环丙沙星的MIC均超过128μg/ml,同时对莫西沙星(MXF)的耐药率为100％。 2.与单用环丙沙星比较,加入黄连素后,敏感菌组对环丙沙星的MIC下降率为35.3%(6/17);临床耐药株组为22.2%(2/9);诱导耐药株组为28.6%(4/14)。3组菌株之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。 3.药物对细菌开始生长的迟缓期并无明显的影响,主要是从对数生长期开始作用,随着时间的延长,生长曲线压低越明显,到了平台期曲线逐渐趋向平稳。作用相同时间下,与空白对照组相比,单用100μg/ml黄连素与500μg/ml黄连素均无明显差异;单用环丙沙星的抑菌效果比单用100μg/ml黄连素或500μg/ml黄连素好;环丙沙星联合100μg/ml黄连素或500μg/ml黄连素后均比单用环丙沙星的抑菌效果好,差异均有统计学意义(P<0.05);500μg/ml黄连素联合环丙沙星的抑菌效果较100μg/ml黄连素更加明显,差异有统计学意义(P<0.05)。而敏感菌、临床耐药菌和诱导耐药菌的生长曲线并无明显差异。 随机挑选敏感菌S10的生长曲线为例,经计算得出:100μg/ml黄连素使环丙沙星的抗菌作用增加了0.3倍,500μg/ml黄连素使环丙沙星的抗菌作用增加了3.4倍,高浓度黄连素的联合抗菌作用是低浓度的3.4倍。 从实验结果显示500μg/ml黄连素的体外联合抗菌效果最佳,因此,我们设想500μg/ml黄连素是人体内最佳的血药浓度,经计算剂量为0.43g。此剂量在人体使用的安全范围内,因此适用于临床。 结论： 1.环丙沙星长期低浓度选择压力易引起细菌耐药,而且还引起喹诺酮类抗菌药物如莫西沙星之间的交叉耐药。 2.黄连素与环丙沙星联用不但能增加环丙沙星对肺炎克雷菌敏感株的抗菌作用,还可以逆转耐药株对环丙沙星的敏感性而达到抗菌目的;而且高浓度黄连素联合抗菌效果较低浓度明显。 3.由本实验推断可得:在临床上予环丙沙星治疗肺炎克雷伯菌引起的感染,尤其是环丙沙星单药治疗效果不佳(出现耐药)时,可加用足量黄连素,以获得低成本、高效用、患者满意的治疗效果。