研究背景涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是较常见的涎腺恶性肿瘤,占涎腺恶性肿瘤的7.5%-10%,可发生于任何年龄,以40-60岁占绝大多数,但女性稍多于男性,好发于腮腺、颌下腺、舌下腺和小涎腺如腭腺。SACC具有嗜神经侵袭(perineural invasion, PNI)的特性,常侵袭神经并沿神经生长向远处转移,这是区别于其它头颈部肿瘤的重要生物学特性之一,并与其复发、转移及预后密切相关。SACC的发展虽较为缓慢,但极易早期侵犯神经并循其扩散,导致面瘫、麻木、疼痛等神经受损症状,给临床治疗带来了很大困难,预后差,因而探讨SACC嗜神经侵袭的机理具有重要的临床意义。除SACC外,在恶性黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、直肠癌中同样存在癌细胞沿神经侵袭的现象。故目前国内外学者倾向于将肿瘤的嗜神经侵袭列为除肿瘤局部浸润、血行转移、淋巴道转移、体腔种植4种途径之外的第5种扩散转移方式。恶性肿瘤的嗜神经侵袭特性早在一个世纪前就被提出。早期研究认为,PNI主要为肿瘤细胞沿神经周围淋巴管的侵袭,现在认为,神经周围在解剖结构上存在一疏松的潜在间隙,并非淋巴管,肿瘤细胞可沿该阻力最小的间隙生长。这种生长方式提示肿瘤细胞可能在早期即出现远处转移,术中即使切除与肿瘤相连的部分神经,由于在远处神经纤维处已出现癌细胞浸润,术后复发的可能性较大。到目前为止,SACC嗜神经侵袭的机理尚不清楚,这也是目前国内外研究的热点。SACC的嗜神经侵袭行为有多种相关基因及信号通路的参与,其中即包括Notch信号通路。Notch信号通路是少数反复调节细胞增殖和凋亡的信号转导系统。研究发现,Notch信号通路与细胞的分化、增殖、凋亡、粘附及表皮细胞向间质转化有密切联系,对大多数组织的正常发育至关重要。在细胞分化过程中,Notch信号的功能有4个方面：(1)参与胚胎发育。Notch信号会上调细胞膜表面的Notch分子,同时下调其配体Delta的表达；反之,Delta的表达对细胞自身Notch分子的表达则有下调作用。(2)参与T细胞发育。(3)维持造血干细胞的自我更新。(4)调节血管生成。Notch异常调控可引起组织发育异常,并可能导致肿瘤的发生,其在肿瘤发生发展中的重要作用有：维护未分化状态；参与细胞命运的决定；诱导终末分化；调节肿瘤血管新生。其机制是Notch受体在邻近细胞产生的配体活化作用下,通过一系列分子间的相互作用,依据不同的组织或细胞背景,对肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等过程发挥不同的调控作用。Notch基因于1919年在果蝇体内发现,该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch), Notch基因由此而得名。1991年,Notch-1在人类的T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定出来,表明了Notch信号通路和肿瘤相关。有研究认为Notch家族基因Notch-1、Notch-2、Notch-4与SACC的发生、发展、转移有关。本课题组在前期研究工作中,结合激光俘获显微切割和人类全基因组芯片技术,首次成功构建出SACC嗜神经侵袭相关基因表达谱,通过实时定量PCR(qRT-PCR)及免疫组化(IHC)方法加以验证,并经过聚类分析和基因功能分析研究其功能,发现Notch-1基因在嗜神经侵袭组中特异性高表达。该研究结果与近期发表的另外两项SACC基因表达谱研究结果相符合。ACC-M细胞株是1996年从ACC-2细胞株中筛选出肺高转移性SACC细胞株,其转移能力与ACC-2相比明显增强,转移率由18%提高至96%,转移灶重量由0.31g提高至0.88g。具有高转移能力的ACC-M细胞株的建立,对于探讨SACC的侵袭、转移机理及有效选择抗侵袭、转移药物提供了一个极为重要的实验模型。尽管SACC嗜神经侵袭的研究近年来有很大进步,但目前这些研究均尚未系统完全的阐明SACC嗜神经侵袭的机理,SACC嗜神经侵袭机理的研究尚处于探索阶段。迄今国内外均未见Notch-1基因沉默抑制人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M体外嗜神经侵袭能力的研究报道。研究目的利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术高效特异地抑制Notch-1基因表达,了解Notch-1基因沉默后,ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力的变化。研究方法1.建立Notch-1基因RNA干扰稳定转染的ACC-M细胞株。以Notch-1为靶基因设计shRNA序列,构建重组慢病毒,转染ACC-M细胞,建立Notch-1基因RNA干扰稳定转染的ACC-M细胞株。2. Notch-1基因沉默对涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC-M)体外增殖、嗜神经侵袭能力的影响。通过MTT法测定细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期的变化、改良Transwell细胞嗜神经侵袭实验检测Notch-1基因沉默对人涎腺ACC-M体外增殖、嗜神经侵袭能力的影响。研究结果1、成功建立Notch-1基因RNA干扰稳定转染的ACC-M细胞株。通过构建Notch-1RNAi慢病毒表达载体pLenR-GPH-Notch-1,并通过双酶切及DNA测序加以鉴定；四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光；浓缩病毒后测定其滴度为5.8×108TU/ml;以复感染系数MO I (multiplicity of infection)为1时感染293T细胞,荧光显微镜下观察到感染效率达90%以上。各组浓缩病毒感染ACC-M细胞后,结合qRT-PCR和Western Blot检测结果,第三组慢病毒载体干扰效果最佳,Notch-1基因在mRNA及蛋白水平的水平均被显著抑制。2、MTT及流式细胞仪研究结果表明,Notch-1基因沉默对ACC-M细胞体外增殖能力无明显影响。改良Transwell细胞侵袭实验证实Notch-1基因沉默可显著抑制ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力。结论1、Notch-1RNAi慢病毒表达载体及其稳定转染细胞株可高效、特异性阻断Notch-1基因表达,是研究其功能的良好工具。2、Notch-1基因沉默对ACC-M细胞体外增殖能力无明显影响,但可显著抑制ACC-M细胞体外嗜神经侵袭能力,提示Notch-1基因有可能成为SACC嗜神经侵袭相关标志物和治疗的靶基因。