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26S蛋白酶体是细胞内最重要的蛋白质降解机器,对维持细胞代谢和机体健康起着重要作用。蛋白酶体结构上分成20S和19S两部分,由33个亚基组成。蛋白酶体受到多种翻译后修饰,磷酸化是其中最普遍的一种,但我们对蛋白酶体上大部分磷酸化位点尚缺乏研究。本课题全面研究了19S亚基Rpn1第361位丝氨酸(Rpn1-Ser361)的磷酸化。该磷酸化位点频繁地被质谱检测到,而且在进化上保守。为探寻Rpn1-Ser361位点磷酸化的生物学意义,我们运用CRISPR/Cas9技术构建了Rpn1-S361A敲入细胞并对其进行SILAC质谱鉴定。在Rpn1-S361A细胞中,蛋白酶体活性被抑制,细胞增殖减慢,出现氧化还原稳态失衡和线粒体损伤。我们用ELISA的方法对人源激酶组进行筛选,最终确定PIM1/2/3是Rpn1-Ser361的主要激酶;同时,体内体外实验证明UBLCP1是该位点的磷酸酶。我们利用密码子扩展技术(genetic code expansion system)从大肠杆菌中纯化出磷酸化的Rpn1-pS361。体外结合实验表明,S361位的磷酸化增强Rpn1和19S亚基Rpt2的结合,进而促进蛋白酶体的组装。本研究首次在分子水平揭示了磷酸化对蛋白酶体组装和功能调控的重要作用。PIM1/2/3介导的Rpn1-Ser361磷酸化为某些特定癌症中蛋白酶体过度激活提供了新的解释,也为PIM抑制剂与蛋白酶体抑制剂在治疗癌症中的联用提供了理论依据。