水稻在其生育期的大部分时间里处于淹水状态，稻田土壤中的氮因厌氧状态下硝化作用受到抑制而以铵态氮为主要的氮素形态。因此，研究水稻根系吸收、利用铵态氮的生理和分子机制对深入了解其氮素营养规律具有重要意义。众多研究表明，植物根系吸收铵态氮的过程是由一类专门的铵转运蛋白（Ammonium transporter，AMT）来承担的。本文通过水培试验比较了水稻在铵、硝营养供应下的生长情况和生理响应，发现铵的吸收利用过程可导致介质pH显著降低，这一现象可被水稻根系所利用，而成为其偏好于铵态氮营养的重要原因。通过对水稻OsAMT1;3正反遗传材料的研究，揭示了根系中的这一吸收系统是水稻利用低pH优势以促进吸铵的过程中不可或缺的。进而通过爪蟾蛙卵电生理、酵母功能互补和定点突变实验证明了OsAMT1;3主导的铵吸收功能的确可受低pH的强烈促进及其控制位点。最后通过盆栽和小区试验进一步研究了OsAMT1;3遗传材料在土壤中的表现及其生物学意义。本文中所获得的主要研究结果如下:　　(1)通过水培试验发现等量浓度处理下，铵态氮比硝态氮对水稻的生长具有更好的支撑作用。同时，纯铵处理溶液的pH发生显著降低，而纯硝处理则使溶液pH略有升高。同时表现出对铵态氮的偏好性—获得较大的生物量增量。进一步通过pH缓冲水培试验，证明了与近中性pH(pH6.5)相比，等量浓度的铵在低pH(pH4.5)时可显著增加水稻的生物量（DJ品种39％，NB品种32％）及含氮量（DJ品种29％，NB品种29％），同时根系生长状况在两个pH下较为接近。非损伤微测结果表明，低pH时水稻根系的铵吸收速率大幅增加(100％)。因此，供铵状态下水稻的生长优势很可能是因为吸铵过程导致根系周围介质酸化而进一步促进了铵的吸收。由于植物的吸铵过程是由AMT转运体负责的，在上述结果的基础上，推测水稻根系中可能存在着受低pH促进的AMT系统。水稻基因组中至少存在10个AMT，其中9个在根部均有表达。利用铵吸收缺失突变体酵母菌株31019b通过功能互补实验进行初步筛选，发现只有OsAMT1;1、1;2和1;3这三个AMT可使酵母菌株在有限的铵作为唯一氮源的培养基上恢复生长，即具有直接介导吸铵的功能。进一步通过比较酵母细胞在酸性(pH4.8)和中性(pH6.8)培养基上的生长发现，表达OsAMT1;3的酵母在酸性pH下具有较快的生长速度。因此，OsAMT1;3可能具有潜在的低pH促进吸铵的功能。进而通过爪蟾蛙卵双电极电压钳电生理技术研究了OsAMT1;3的功能特征和调控机制。证明了OsAMT1;3是一典型的高亲和(Km为25μmol/L)、NH4+离子单向转运体;OsAMT1;3介导的铵吸收电流(1mmol/LNH4+)在pH5.4和pH6.4下电流分别比pH7.4时增加了63％和29％，最大吸收速率Vmax则分别增加了135％和70％。因此，OsAMT1;3在功能上的确具备低pH下促进吸铵的调控特征。另外已有报道也表明，OsAMT1;3基因主要在水稻根中表达。其上述功能特征也与水培试验观测到的现象极为吻合。　　(2)为了验证OsAMT1;3在水稻铵吸收过程中的生理功能，构建了该基因的过表达株系，并购买了相关突变体水稻材料(knockdown(KD)株系，背景为Dongjin水稻，OsAMT1;3在根中的丰度降低约90％）。用这些正反遗传材料进行水培试验和SIET测试，发现OsAMT1;3突变体株系丧失了低pH下促进吸NH4+和相应的生物量增量，而过表达株系则强化了这一效应。初步田间小区试验结果也验证了这一现象:与野生型水稻相比，突变体水稻株系生育后期剑叶和倒二叶的游离NH4+含量显著降低，而过表达OsAMT1;3株系的游离NH4+含量则有较显著增加;说明OsAMT1;3直接贡献于水稻的NH4+吸收。　　为进一步验证OsAMT1;3在低pH下促进吸铵的实际效果，采取了酸性(pH5.2)水稻土，将其pH调高2个单位，施以中量的铵态氮，进行盆栽试验。结果表明，仅野生型水稻重现了在低pH下促进生长的现象，生长状况:原pH5.2土壤＞调高至pH7.2;而突变体株系在任何pH下的土壤中，生长状况没有显著差异。这些结果证明了水稻在低pH下强化铵吸收能力并促进生长的过程是由OsAMT1;3承担的。　　(3)根据蛙卵电生理研究结果，将OsAMT1;3介导的铵吸收电流与pH之间的关系进行拟合，拟合曲线的pKa约为7.2，这与组氨酸(Histidine，H)的滴定常数非常接近;由于低pH（质子）对OsAMT1;3功能的调控发生在细胞膜外，因此推测OsAMT1;3的pH敏感性可能是由一个或者几个暴露于细胞膜外的组氨酸决定的。通过蛋白质二级结构预测软件定位了OsAMT1;3中暴露于细胞膜外的7个组氨酸，对其进行逐一定点突变，并在蛙卵中验证其pH效应，明确了第104位氨基酸H104对OsAMT1;3接受质子调控的控制作用;将H104突变成其他的5个氨基酸A、R、E、Q、K，虽能保持OsAMT1;3的吸铵功能但丧失了质子对吸铵过程的促进作用。这些结果表明H104位点的不可替代性，也预示了该位点可能与OsAMT1;3蛋白质结构中的NH4+吸收通路的门控元件直接相互作用（如，形成氢键等作用力）。利用已解析的大肠杆菌铵转运蛋白EcAmtB的晶体结构进行同源建模分析，预测了H104在空间位置上与两个苯丙氨酸门控系统中的F127距离最近，大约有2-3个水分子的距离。F127通过其苯环，W168利用其π键，S255利用氢键其共同组成NH4+结合位点。由此，H104可能通过水分子链的传递作用，与F127产生键合作用力进而调控底物NH4+的结合状态，使其能在质子影响下发生有利于NH4+离子通透的构象改变。　　(4)水培结果显示pH4.5下分蘖期OsAMT1;3表达水平比苗期提高约5倍;初步田间试验结果显示，OsAMT1;3突变体株系的有效分蘖数降低而过表达株系则有较显著增加。分蘖期和孕穗期是水稻的强烈需氮期。推测在该时期水稻强烈吸铵导致根际pH降低，从而启动OsAMT1;3主导的低pH吸铵能力增强，迅速满足其氮素需求。OsAMT1;3在支撑水稻生长发育中的强烈需氮过程中发挥重要作用。　　(5)在水稻OsAMT1;3功能及其所特有的质子促进调控机制研究的同时，通过蛙卵电生理技术对来源于非喜铵模式植物拟南芥的AtAMT1;3进行了功能上的比较研究。结果表明AtAMT1;3也是一个高亲和(Km为18μmol/L)的NH4+单向转运体，但其吸铵功能不受pH调控。另外，根据已有的报道，植物AMT蛋白中的某些位点突变后会对其吸铵功能发生促进或强烈阻碍作用。针对OsAMT1;3除主要通透NH4+离子之外，也可微弱吸收其有毒类似物MeA+的特性，通过点突变和酵母功能互补、蛙卵电生理试验研究了影响OsAMT1;3离子通透能力的位点:1）H199E突变导致OsAMT1;3失去吸铵功能;2）L56F突变则使OsAMT1;3对NH4+和MeA+的通透性分别增加了3-5倍和2-3倍。表达该点突变的酵母细胞在高铵和高浓度MeA+培养基上表现出明显的中毒现象。吸收动力学结果显示L56F突变使OsAMT1;3对NH4+和MeA+的最大吸收速率Vmax均增加了6倍左右。此外，酵母细胞在高浓度Na+(200mmol/L甚至500mmol/L)培养基上的生长减缓现象和在蛙卵细胞中观测到L56F点突变可大幅增加Na+通透电流（增幅约为1倍），表明该突变也增强了对Na+的通透。因此，OsAMT1;3氨基酸序列中的第56位L→F的突变，可通过增强离子的通透性而促进其吸收功能。考虑到这三种离子的通透能力随着其离子半径的增加而减小(NH4+＜MeA+＜Na+)，L56F突变可能拓宽了OsAMT1;3蛋白空间结构中的底物穿过通道的孔径，进而使其吸收能力大幅增加。L56位点未来可用于水稻氮高效吸收利用基因改造或者氮高效自然变异品种筛选的靶标。　　综上所述，水稻铵态氮营养比硝态氮营养更具生长优势的主要原因是铵态氮吸收导致的介质酸化，酸化又激活了水稻铵吸收系统中唯一的吸铵功能在低pH下增强的铵转运蛋白OsAMT1;3，进而增强对铵态氮的吸收;OsAMT1;3的pH调控是通过H104起作用的。分蘖期表达丰度的急剧上调以及田间遗传材料有效分蘖数的改变预示OsAMT1;3在支撑水稻生长发育中的强烈需氮过程中发挥重要作用。另外，对非喜铵植物拟南芥中的AtAMT1;3进行了功能比较研究以及确定了微调OsAMT1;3功能的位点L56。