第一部分 经阴道分娩和剖宫产对新生儿早期肠道菌群构成的影响目的：本项研究旨在利用16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术阐明经阴道分娩和剖宫产两种生产方式对新生儿早期肠道菌群多样性的影响。方法：收集生后2天和4天新生儿的大便样本(经阴道分娩婴儿25例,剖宫产婴儿16例)。利用16S rDNA PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析大便样本的菌群多样性,利用16S rRNA基因测序技术对DGGE条带进行测序以明确细菌种类。结果：生后2天经阴道分娩和剖宫产新生儿肠道菌群的多样性指数：Shannon指数分别为1.94±0.29及2.30±0.25；Simpson指数分别为0.15±0.05及0.11±0.28；Shannon均匀度指数分别为0.95±0.25及0.97±0.15。生后4天经阴道分娩及剖宫产新生儿的肠道菌群多样性指数：Shannon指数分别为2.32±0.12及2.64±0.14；Simpson指数分别为0.10±0.01及0.07±0.10；Shannon均匀度指数分别为0.98±0.08及0.99±0.05。经阴道分娩及剖宫产两组丰富度及均匀度指数无统计学差异(P>0.05)。经阴道分娩及剖宫产两组在肠道菌群种类构成方面具有显著差异：经阴道分娩新生儿大便菌群以大肠杆菌(占92.86%)、拟杆菌属(占78.57%)和长双歧杆菌(占83.33%)为主。剖宫产新生儿大便菌群则以葡萄球菌属(占72.73%)、梭菌属(占45.45%)、肠杆菌属(占45.45%)和链球菌属(占70.00%)为主。结论：本研究的结果表明经阴道分娩和剖宫产新生儿肠道菌群的菌群种类有显著差异,生产方式可影响肠道菌群种类组成。第二部分 新生儿晚发败血症多重病原菌检测方法探讨第一章16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术检测新生儿晚发败血症多重致病菌可行性的初步探讨目的：探讨利用16S rDNA PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)结合测序技术对新生儿晚发败血症多重病原菌进行检测的可行性。方法：收集14份诊断为败血症患儿的血液样本及制作24例模拟败血症血液样本(将不同稀释浓度粪肠球菌的DNA分别添加至固定浓度的铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌DNA混合液中),利用16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术对血液样本中的病原菌进行检测。将检测结果与血培养结果进行比较分析。结果：14例血培养阳性血液样本中有5份样本16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术所检测到的病原菌种类部分或全部与血培养结果相同。另9份样本中,血培养未能检测到奈瑟菌属、莫拉克斯菌属等分子生物学方法所发现的细菌。而16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术亦未能将肺炎克雷伯菌和粪肠球菌等血培养证实的病原菌检出。对模拟败血症样本进行病原菌种特异性PCR及16S rDNA PCR-DGGE检测发现仅含粪肠球菌DNA的样本粪肠球菌的最低检测限为稀释57倍(8.32×10-4ng/μl),而与铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌混合添加样本中,粪肠球菌DNA最低检测限仅为稀释52倍(2.60ng/μ1)。结论：16S rDNA PCR-DGGE结合测序技术与传统血培养方法相比可检测到更广的多重病原菌谱。而其应用会受到16S rDNA PCR扩增过程中的竞争性抑制现象的影响。在实际应用时需注意这种竞争性抑制现象可能导致的假阴性结果。第二章16S rDNA PCR-DGGE在检测败血症血标本时外源性细菌DNA污染问题的初步探讨目的：对16S rDNA PCR-DGGE检测败血症血标本时的外源性细菌基因组DNA污染问题进行初步研究与探讨。方法：收集晚发败血症和新生儿黄疸(非感染引起)新生儿的血液样本各14例和10例。分别以未使用溶菌酶溶液与使用溶菌酶溶液(对照组)对上述血液样本进行细菌DNA的提取,再行16S rDNA PCR-DGGE检测,比较两种DNA提取方法所得出的DGGE图谱之间的差异。结果：不同血液样本使用溶菌酶进行血液细菌DNA提取后经16SrDNA PCR-DGGE检测所得到的DGGE图谱完全一致,表现为电泳位置完全相同的条带图谱,测序后显示为弧菌属、大肠杆菌及气单胞菌属。未使用溶菌酶进行血液细菌DNA提取,新生儿败血症血标本中检测出包含有表皮葡萄球菌、棒状杆菌属、盐单胞菌属以及丙酸菌属等细菌。阴性对照组(新生儿黄疸血液)和空白对照组(ddH2O)样本则分别检出数量和电泳位置明显不同的14个条带和17个条带。结论：血液内细菌DNA提取过程中溶菌酶溶液所含的外源性细菌DNA可能是16S rDNA PCR-DGGE检测时败血症血样本与对照组样本中均存在的细菌DNA的污染来源。