柿果实采后易软化,不耐贮运,影响其商品价值。因此,研究柿果实成熟软化的分子机制,对培育耐贮新品种或完善柿果实贮藏保鲜技术均有重要的指导意义。柿是呼吸跃变型果实,乙烯在柿果实成熟过程中起关键作用。油菜素内酯是一类新型植物激素,对植物有多重生理作用,包括影响果实成熟。ERF和BZR分别是乙烯和油菜素内酯信号转导途径的转录因子,关于ERF和BZR在柿果实成熟软化中的具体机制鲜有报道。本文以采后软化速度快的‘富平尖柿’果实和软化速度慢的‘新昌牛心柿’果实为试验材料,利用q RT-PCR、蛋白免疫印记、双荧光素酶试验、凝胶迁移试验和基因瞬时过表达试验等研究方法,筛选柿果实成熟软化相关基因,并分析其功能,探究乙烯和油菜素内酯在采后柿果实成熟软化过程中的调控作用。主要研究结果如下:1.分别利用两种耐贮性不同的柿品种和两种采后处理,筛选与柿果实成熟软化相关的基因。‘富平尖柿’果实采后软化速度快,‘新昌牛心柿’果实采后软化速度慢。透射电子显微镜观察结果显示柿果实软化伴随着中胶层降解和细胞壁膨胀。贮藏至第18天时,‘新昌牛心柿’的细胞壁保持相对完整,而‘富平尖柿’的细胞壁扭曲变形。通过q RT-PCR分析乙烯和1-MCP处理对柿ERF基因、细胞壁修饰基因和乙烯生物合成基因表达的影响,初步得到21个响应乙烯的基因,包括Dk ERF8/16/18/19/24、Dk PG1、Dk PL1、Dk PE1/2、Dkβ-GAL1、Dk EGase1、Dk XTH2/9/10/11、Dk MAN1、Dk EXP4、Dk ACS1/2和Dk ACO1/2,它们的表达受乙烯处理诱导同时被1-MCP处理抑制。除了‘新昌牛心柿’中的Dk MAN1,其他基因的表达量在两个品种中均随果实乙烯释放量的增大而提高,说明它们均与乙烯介导的柿果实成熟软化相关。此外,Dk ERF16、Dk PG1、Dk XTH2/9/10、Dk MAN1、Dk EXP4和Dk ACS2在‘富平尖柿’果实整个贮藏期间的转录水平显著高于‘新昌牛心柿’。2.研究了ERF转录因子对柿果实成熟软化相关功能基因的调控作用。通过染色体步移法成功分离得到Dk PG1、Dk PL1、Dk PE1/2、Dkβ-GAL1、Dk EGase1、Dk XTH2/9/10/11、Dk MAN1、Dk EXP4、Dk ACS1/2和Dk ACO1/2的启动子序列,这些柿果实成熟软化相关基因的启动子序列中均有ERF转录因子结合元件。双荧光素酶试验、启动子定点突变试验和凝胶迁移试验的结果表明,Dk ERF8、Dk ERF16、Dk ERF18分别结合Dk XTH11、Dk EXP4、Dk ACS2的启动子并激活其活性。烟草亚细胞定位结果显示Dk ERF8和Dk ERF18定位在细胞核,Dk ERF16定位在细胞核和细胞膜。瞬时过表达试验结果显示,过表达Dk ERF8和Dk ERF18促进柿果实酸溶性果胶向水溶性果胶的转化,过表达Dk ERF16和Dk ERF18促进乙烯释放。这些结果表明Dk ERF8/16/18通过促进细胞壁降解和乙烯生物合成参与柿果实成熟软化。3.外源油菜素内酯处理促进柿果实成熟软化。柿果实贮藏过程中内源油菜素内酯和油菜素甾酮的含量在贮藏前期小幅上升,6-脱氧油菜素甾酮的含量在整个贮藏期保持不变。使用24-表油菜素内酯(EBR)处理可以促进采后柿果实成熟,促进硬度下降及乙烯释放。EBR处理降低了柿果实酸溶性果胶和纤维素含量,提高了水溶性果胶含量以及多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶和纤维素酶的活性,促进了Dk PG1、Dk PL1、Dk PE2、Dk EGase1、Dk ACS1、Dk ACS2和Dk ACO2基因表达。4.明晰了BZR转录因子对柿果实成熟软化过程中油菜素内酯响应基因的调控作用。利用转录组数据克隆得到了4个柿Dk BZRs基因,其中Dk BZR1/2在柿果实中表达。在柿果实贮藏期间,Dk BZR1蛋白水平逐渐下降,去磷酸化状态的Dk BZR2蛋白逐渐积累。烟草亚细胞定位结果显示Dk BZR1/2定位在细胞核和细胞质上,当使用EBR处理后,Dk BZR1/2向细胞核聚集。双荧光素酶试验和凝胶迁移试验结果表明,Dk BZR1可以结合Dk EGase1和Dk ACS1启动子的BRRE元件并抑制启动子活性;Dk BZR2可以结合Dk PL1和Dk ACO2启动子的E-box元件并激活启动子活性。EBR处理可以显著增强Dk BZR2对Dk PL1和Dk ACO2启动子的调控效应。瞬时过表达试验结果显示,过表达Dk BZR2促进柿果实酸溶性果胶向水溶性果胶的转化,并且促进乙烯释放。以上结果表明Dk BZR1和Dk BZR2分别作为转录抑制子和转录激活子参与柿果实成熟软化。