目的:PD-1/PD-L1信号通路频繁出现在肿瘤微环境中,通过抑制肿瘤浸润淋巴细胞,尤其是CD8~+T淋巴细胞的活性而抑制肿瘤免疫。PD免疫治疗主要通过刺激肿瘤周围区域的免疫反应,但是不足以阻止肿瘤的进展。越来越多的证据表明,分割放疗不仅能够直接导致肿瘤细胞死亡,还能促进机体抗肿瘤免疫的产生。因此,本研究探讨了PD免疫联合分割放射治疗对淋巴瘤抗肿瘤免疫和肿瘤生长的影响。方法:1、体外照射EL4细胞后PD-L1表达检测和小鼠淋巴瘤模型的建立体外用不同辐照剂量辐射EL4淋巴瘤细胞后采用流式和免疫组化法检测PD-L1的表达;在C57BL/6小鼠背部两侧皮下分别注射接种EL4淋巴瘤细胞,待肿瘤生长至约100-150mm~3时,将小鼠分为4组:IgG对照组;PD1单抗单独治疗组;分割放疗单独治疗组;PD1单抗联合放疗治疗组,记录并统计小鼠肿瘤体积发生的变化和生存率。2、小鼠肿瘤组织免疫微环境的检测通过给各组小鼠不同的治疗,治疗结束后7天取出小鼠背部两侧的肿瘤,采用免疫组织化学的方法对所取各组肿瘤标本进行CD3、CD4、CD8、FOXP3、PD-1、PD-L1等分子的标记。根据每视野阳性细胞所占比例和阳性部位颜色深浅综合分析,进行半定量统计,分析它们的表达情况以分析肿瘤组织免疫微环境的改变。3、联合治疗后激活的适应性免疫反应通过给各组小鼠不同的治疗,治疗结束后7天取出小鼠脾、血液、引流淋巴结,采用流式染色,标记CD45、CD3、CD4、CD8、CD11b、GR1,用Flowjo统计它们的表达情况以分析联合治疗后激活的全身免疫反应。4、联合治疗刺激机体产生抗原特异性的CD8+T细胞反应采用ELISA法检测小鼠的血清分析干预治疗后IL-2和IFN-γ的水平差异;采用MTT法检测各组小鼠脾细胞中CTLs特异性杀伤靶细胞EL4的能力。5、探索联合治疗的最佳给药顺序通过设计四种不同的联合治疗的顺序:A、抗PD-1单抗在分割放疗的第一天开始给;B、抗PD-1单抗在第二次分割放疗的当天开始给;C、抗PD-1单抗在分割放疗前4天开始给;D、抗PD-1单抗在分割放疗结束后4天开始给。记录并统计小鼠肿瘤体积发生的变化和生存率。结果:1、辐照可以使EL4肿瘤细胞表面PD-L1表达升高;在我们研究的荷EL4淋巴瘤的小鼠模型上,放疗联合抗PD-1单抗比放疗或抗PD-1单抗单独治疗能更好地控制肿瘤生长,且辐照区域以外的肿瘤也得到了控制,产生远隔效应。2、联合治疗组辐照侧和对侧肿瘤组织免疫微环境中CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞均比对照组及单独治疗组高,而FOXP3~+Treg细胞辐照侧和对侧均比对照组及单独治疗组低。单纯分割放疗诱导了肿瘤表面PD-L1和淋巴细胞的PD-1表达上调。3、联合治疗组小鼠脾、血液、引流淋巴结中CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞比对照组及单独治疗组高,而MDSCs比对照组及单独治疗组降低。4、联合治疗组小鼠血清中IL-2和IFN-γ的水平比对照组及单独治疗组高。联合治疗组CTLs特异性杀伤靶细胞EL4的能力比对照组及单独治疗组强。5、抗PD-1单抗在分割放疗结束后4天开始给这种联合治疗的顺序治疗小鼠淋巴瘤模型效果最佳。结论:在淋巴瘤荷瘤小鼠模型上,分割放疗联合抗PD-1单抗刺激机体产生了全身性免疫应答。联合治疗抑制了辐照侧和辐照区域以外肿瘤的生长,从而产生远隔效应。此外,抗PD-1单抗在分割放疗结束后4天开始给药这种顺序治疗小鼠淋巴瘤模型效果最佳。