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硫过氧化物还因为子(SRX)是一类新的过氧化物酶,目前发现只存在于真核生物细胞中。它可与有两个保守半胱氨酸的过氧化物还因为子2-Cys PRX(2-CP)相互作用,还原过氧化形式的2-CP(HO-2CP)使其恢复还原活性。由于2-CP是一类高丰度的过氧化物酶,在叶绿体中参与活性氧的清除,所以SRX在维持细胞中2-CP的还原功能和氧化还原平衡方面发挥着重要作用。目前有关SRX的研究在哺乳动物中已取得巨大进展,但是高等植物中研究进展缓慢。本论文利用遗传学和分子生物学手段比较深入地研究了小麦TaSRX基因的遗传学特性、生理功能和功能分化及其依赖的分子机制。
首先根据小麦EST数据库搜索结果设计跨内含子的保守引物,并对PCR扩增产物进行随机测序和片段分析,确定TaSRX基因在小麦基因组有3个拷贝,并结合小麦基因组和BAC的Southern blot分析来共同验证随机测序和片段分析的结果。TaSRX的部分同源基因在六倍体小麦中只有3个拷贝,根据染色体定位的结果分别命名为TaSRX-A1,TaSRX-B1和TaSRX-D1。TaSRX-A1,TaSRX-B1和TaSRX-D1分别定位在六倍体小麦染色体7AS、7BS和7DS上。
器官水平的分析结果表明TaSRX的表达多集中在不同时期的叶片中。TaSRX的成熟蛋白TaSRX-A1,TaSRX-B1和TaSRX-D1都定位于叶绿体当中,这和拟南芥AtSRX的亚细胞定位是一致的。
在小麦品种小偃54(XY54),与野生型植株比较,TaSRX的部分沉默导致小麦叶片在光胁迫条件下更加容易发生光抑制,NPQ增大,PSⅡ实际光化学效率下降,光合电子传递速率下降。同时H2O2含量上升更多,水-水循环酶活性增大,HO-2CP的含量增多,叶绿体类囊体光合复合体降解水平增高。引入林可霉素抑制蛋白从头合成,叶绿体类囊体光合复合体遭受光破坏的程度更大。这表明TaSRX具有降低光系统光抑制和维护光合系统效率的功能。进一步的基因沉默实验表明TaSRX在不同品种遗传背景下发挥作用的程度是不一样的。与XY54相比,TaSRX的部分沉默导致小麦品种京411(J411)光抑制程度更大,J411的叶绿体类囊体光合复合体降解程度更大,HO-2CP的含量更多。
转基因拟南芥和豌豆早褐病毒(pea early browning virus,PEBV)载体介导TaSRX过表达的烟草植株的分析进一步表明TaSRX确实具有降低光系统光抑制和维护光合系统效率的功能。Paraquat耐受实验的结果表明TaSRX三个拷贝间在抗氧化和清除活性氧功能上存在强弱差异,TaSRX-AJ>TaSRX-B1>TaSRX-D1。结合烟草中TaSRX的瞬时表达和免疫共沉淀技术分析TaSRX与2-CP的作用,发现三种TaSRX都能和2-CP相互作用,但是结合效率有差异,表现为TaSRX-A1>TaSRX-B1>TaSRX-D1,这可能是造成三个拷贝间抗氧化功能差异的一个重要分子机制。TaSRX-A1和TaSRX-D1的交互突变表明Cys60造成了TaSRX-D1抗氧化功能的减弱。
TaSRX的研究结果可能为今后高光效和耐胁迫小麦品种的培育提供理论指导和基因资源。TaSRX功能分化的研究刚刚揭开序幕,多物种的分析和超亚细胞定位技术的发展可能进一步揭示出该基因的新功能。