论文部分内容阅读
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染性疾病。病鸭表现为角弓反张，剖检可见肝脏肿大，表面树枝状充血或出血性斑点。20世纪以来其成为危害雏鸭最为严重的传染病之一，给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。DHV通常分为3个血清型，其中Ⅰ型和Ⅲ型属于小RNA病毒科（Picornaviridae），Ⅱ型属于星状病毒科(Astroviridae)。近年来，鸭病毒性肝炎出现了新的流行趋势，我国目前常用的Ⅰ型DHV弱毒疫苗或灭活疫苗对该病的防治效果不甚理想，国内外学者又陆续报道分离到与Ⅰ型DHV具有相同基因组结构、不同血清型的新型DHV，命名为：“血清Ⅰ型”、“台湾新型”、“韩国新型”，而将基因型划分为A型(DHV-A)、B型（DHV-B）和C型(DHV-C)。
本文从2007～2009年华南地区各鸭场疑似鸭肝炎病料中分离了18株病毒，其中15株DHV-C和3株DHV-A。将以上部分分离毒株进行了病毒传代、动物回归试验、病毒毒力测定、病原学检测等生物学特性试验。其中，鸭胚第5代毒(DE5)对鸭胚、雏鸭、BHK-21病毒毒力测定结果显示：FS ELD5o为10-6.767/0.2mL、SSl ELD50为10-5.4/0.2mL、R ELD50为10-4.4/0.2mL、ZJ ELD50为10-6.3/0.2mL;毒株对9日龄麻鸭的LD5o为：ZJ DE5的LD5o为10-6.4/0.2mL，FS DE5的LDso为10-6.8/0.2mL，R株DE5的LDso为10-4.5/0.2mL，SSl DE5的LDso为10-5.5/0.2mL;ZJ DE5的TCIDso为10-6.5/0.2mL，FS DE5的TCIDso为10-5.9/0.2mL，R株DE5的TCID50为10-3.9/0.2mL，SS1DE5的TCIDso为10-4.1/0.2mL。综合分析，FS、ZJ株为强毒株，SS1株为中等毒力毒株，R株为弱毒株。通过RT-PCR和鸡胚中和试验进一步证实了我国华南地区鸭肝炎病毒存在两种血清型的流行趋势。
为了掌握华南地区鸭肝炎病毒(DHV)的遗传进化规律，本试验对2007～2009年华南地区分离的18株DHV进行了全基因组序列测定，结果表明各毒株基因组均具有5UTR、ORF、3UTR及17nt-23nt的poly(A)尾。Ⅰ型DHV和新型DHV主要在5UTR、3UTR和VP1基因上存在差异。各基因序列相似性和遗传进化树分析结果表明：所分离的3株Ⅰ型DHV均分布在Ⅰ型DHV(基因A型)遗传谱系，与基因B型和基因C型遗传距离较远，不在同一分支上。R株与疫苗株遗传关系最近，基因相似性最大，提示R株可能由疫苗株演化而来。15株新型DHV分布在基因C型谱系中，与国内新型遗传关系较近，处于同一小分支中。VP1氨基酸序列比对分析表明：VP1的高变区主要分布在46～64，95～149，180～223位，尤其是C’末端，存在点突变或连续变异。在第145～146位，15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸（G和G）。VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RGD基序，在DHV中分别显示为SGD和QSD。Ⅰ型和新型DHV的VP3基因在第78位～107位和第143～234位存在不连续的多位点差异。由此推测危害华南地区鸭场的DHV部分序列已发生变异，以及两种基因型DHV的流行，初步认为是导致鸭场雏鸭免疫失败的原因之一。
此外，本研究还建立了检测基因A型DHV和基因C型DHV的鉴别RT-PCR检测方法。结果表明，该方法特异性好，能够特异性地扩增出基因A型DHV和基因C型DHV，敏感性高，分别检测出模板含量为0.8ng/μL和lng/μL的基因A型DHV和基因C型DHV，并可用于病毒的分离鉴定、临床样品的检测及流行病学调查。