论文部分内容阅读
活性氧(ROS)是化学性质非常活跃的一类物质,常见的活性氧包括过氧化氢(H2O2)、烷基过氧化物(ROOH)、羟自由基(HO·)、超氧阴离子（O2-）等。活性氧的大量积累会导致疾病的产生,例如阿尔茨海默病症、帕金森症、癌症、衰老等。
过氧化物还原酶peroxiredoxin(Prx,EC1.11.1.15)是一种抗氧化蛋白,通过其过氧化物还原酶活性来保护细胞免受过氧化氢、烷基过氧化物等活性氧的攻击。Prx的催化活性依靠自身的具有氧化还原活性的半胱氨酸来实现的。在2-CysPrx中参与催化循环的活性半胱氨酸有两个,分别称作peroxidaticcysteine(CP)和resolvingcysteine(CR)。CP是直接攻击底物过氧化物的残基,在进化水平上非常保守,且通常位于N端。CR负责攻击被氧化后的CP从而形成CP-CR二硫键。在l-CysPrx中参与催化过程的活性的半胱氨酸只有CP,CR并不存在。目前关于Prx的催化循环研究中,主要集中于不同类型的Prx催化底物分解的机制上,而Prx再生过程仍不是很清楚。
烷基过氧化物还原酶Ahp1是酿酒酵母中五种Prx(Tsa1,Tsa2,Prx1,Dot5和Ahp1)之一。AHPI基因缺失酵母菌株对叔丁基过氧化氢(t-BOOH)变的敏感。从氨基酸序列分析来看Ahp1归属于Prx5亚家族成员。而从文献报道的催化机制来看Ahp1是一种typical2-CysPrx,其CP和CR分别是Cys62和Cys120,能够形成Cys62-Cys120分子间二硫键。然而,我们的酶活实验和生物信息学分析表明CP和CR分别是Cys62和Cys31。而且2.40(A)的氧化型Ahp1的晶体结构显示形成了Cys62-Cys31分子间二硫键。因此,CR应当是Cys31而不是之前报道的Cys120。综合分析发现Ahp1代表了一种新型的typical2-CysPrx,该类Prx具有独特的四个特点:第一、在蛋白质一级序列上CR位于N端且在CP之前;笫二、CP-CR分子问二硫键跨越A-type二聚体作用界面:第三、从结构上来讲,该类型更类似于atypical2-CysPrx和1-CvsPrx。而从催化机制上更类似于typical2-CysPrx;第四、该类Prx主要分布于Prx5亚家族中的部分真菌和细菌中。酶促反应动力学研究显示Ahp1对底物t-BOOH的结合具有正协同效应,Hill系数大约为2。正协同效应的存在使得Ahp1能够更加快速的清除过氧化物,这也从另一方面体现了Ahp1在进化过程中组装为二聚体形式的优越性。我们获得了2.91(A)的还原型Ahp1的晶体结构,跟氧化型结构的比较能够展示在氧化还原过程中的结构变化。结果显示发生较大构象变化之处主要在于CP和CR的附近区域,具有催化活性的还原型Ahp1—旦催化底物过氧化物分解之后,CP所在的a2螺旋的前两圈部分(Ser59-His66)发生解旋形成环区,并向CR方向移动。同时,CR所在区域的Gln23-Lys32部分向里移动,并与CP形成CP-CR分子间二硫键。这种氧化型的Ahp1处于失活状态,等待含有巯基的氧还蛋白如硫氧还蛋白(Trx)提供电子使之还原。为了揭示Ahp1被Trx2再生的过程,我们通过5,5()二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)交联的方法确定了Trx2的Cys31攻击了氧化型Ahp1中的Cys31,形成了过渡态的分子间二硫键连接的Ahp1-Trx2复合物。我们纯化了此复合物并且解析了其2.10(A)的晶体结构。结构显示,Trx2从氧化型Ahp1二聚体的两侧识别并攻击二硫键中的Cys31,形成了Trx2的Cys31与Ahp1的Cys31以二硫键连接的瞬时中间状态。Trx2通过保守的四对主链氢键和一对侧链氢键识别Ahp1的Asp29-Met33区域,同时rrx2上的疏水补丁(活性中心附近的Trp30-Pr033及Met73)通过疏水相互作用分别结合在Ahp1的疏水区域Met33和Pr060上,从而进一步稳定Ahp1-Trx2复合物。据此复合物推测,催化循环的下一步应该是Trx2的Cys34攻击Ahp1-Trx2复合物的二硫键形成Cys31-Cys34分子内二硫键连接的氧化型Trx2和还原型的Ahp1。于是电子从Trx2传递到Ahp1上,使Ahp1被还原而重新具有了催化活性,完成了催化循环。目前为止,Ahp1-Trx2复合物结构是第一个Trx跟Prx或具有Trx-Iikefold的蛋白形成复合物的晶体结构,也为Trx跟Prx之间的电子传递的研究提供了结构基础。
最近的文献报道,在酿酒酵母中Ahp1的Lys32能够被类泛素蛋白Urml共价修饰。然而这种修饰的功能目前并不清楚。Lys32位于参与催化循环的活性残基Cys31的后面,而且Lys32位于Trx2的结合环区上,因此Ahp1被Urml共价修饰后是否能影响其催化和再生过程？我们通过突变实验证实Ahp1的Lys突变为Ala或Glu时其再生效率有所下降,当突变为Glu时的再生效率的大约只有野生型的1/3。而且当Lys32被Urml共价修饰后可能产生立体阻碍效应。因此我们推测Ahp1被Urml共价修饰可能降低或者丧失其过氧化物酶活性。