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我国贝类养殖中,三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是重要的双壳贝类之一,育珠插核过程中伤口容易受到病原体侵染,使育珠蚌的吐核率升高,甚至造成蚌的死亡。因此,开展对其分子免疫及伤口修复机制的研究具有重要的理论和实际意义。本实验采用RACE PCR技术克隆出了三角帆蚌2种金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1、TIMP2)的cDNA序列,通过实时荧光定量PCR方法检测2种基因在健康蚌鳃、外套膜、闭壳肌、血淋巴、肝胰脏5种组织中的表达情况;以及嗜水气单胞菌和肽聚糖(PGN)刺激后,2种基因在血液和肝胰脏中的表达变化;通过建立创伤修复模型,利用RT-PCR方法检测2种基因在伤口修复期间各时间段的表达情况;利用原核表达技术对2种基因进行了原核表达,检测了重组蛋白对金属蛋白酶的抑制活性。TIMP1基因的cDNA全长序列为1160 bp,其中5’UTR(非编码区)有40 bp;3’UTR有412 bp;开放阅读框(ORF)的碱基长度为708 bp,由235个氨基酸组成。经Expasy在线网站的Signal P 4.0分析氨基酸发现该蛋白含有信号肽序列,该蛋白理论分子量为27.26 kDa,等电点为8.89,带负电荷残基的总数(Asp+Glu)有26个,带正电荷的残基的总数(Arg+Lys)有35个。克隆得到的TIMP2基因序列长度729 bp,其中5’UTR 38 bp,3’UTR长度为238bp,开放阅读框长度为453 bp,共编码150氨基酸,经分析发现该蛋白含有信号肽序列。推导的蛋白分子量为16.58 kDa,等电点为8.72。带负电荷残基的总数(Asp+Glu)为11,带正电荷的残基的总数(Arg+Lys)为15。TIMP1,2基因的mRNA在健康蚌的血液、外套膜、肌肉、鳃和肝胰腺中均有表达。其中,TIMP1在血液中表达量最高,外套膜中最少。TIMP2在肌肉中表达量最高,其次是血液。嗜水气单胞菌刺激后,TIMP1在24 h的血液中表达量极显著性上升,肝胰脏中表达无明显变化;TIMP1在PGN刺激后6 h的血液中极显著性上调,在肝胰脏中表达量无显著变化。TIMP2经PGN和嗜水气单胞菌刺激后在肝脏中表达量变化不明显,经PGN刺激后在血液中表达量上调,在48 h表达量最高。嗜水气单胞菌刺激在血液中呈上调趋势,3 h表达量最高。TIMP1,2基因在创伤后的第1 d表达量最高,随着时间的增加,2种基因的都具有降低趋势的表达量,到达第15 d时恢复到初始水平。将三角帆蚌TIMP1,2基因的扩增产物和表达载体pET-32a利用ECORI、HindIII双酶切之后,连接并成功构建了pET-32a-TIMP1和pET-32a-TIMP2原核表达重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行原核表达,结果表明重组蛋白均存在于沉淀中,纯化出了蛋白,TIMP1蛋白浓度为0.140 mg/m L,TIMP2的蛋白浓度为0.310 mg/mL,逆向明胶酶谱法检测结果显示重组TIMP1和TIMP2蛋白均能够抑制人MMP2的活性。