前言随着人口的老龄化,盆底功能障碍性疾病(Pelvic Floor Dysfunction, PFD)已经被越来越多的人重视,它已经成为众所周知的老年性疾病的一种,主要包括盆腔脏器脱垂(pelvic organ prolapse, POP)和压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)。POP与SUI常并存,其病因和发病机理多样。近几年来对PFD的研究主要集中在影像学、胶原代谢、生物力学、雌激素及其受体等方面,而对神经肌肉生理学研究甚少。正常阴道壁有丰富的神经纤维分布,根据盆底神经损伤机制,推测盆底组织神经递质的改变也可能参与PFD的发病。早在八十年代,就有研究发现阴道壁内有肽能神经纤维,也有研究发现,人类生殖系统存在血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、神经肽Y(neuropeptideY, NPY)、P物质(substance P, SP)、降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide,CGRP)、生长抑素(somatostatin)等神经肽,以血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)最为丰富。NPY是1982年瑞典Karolinska学院的Tatemoto首先从猪脑组织中纯化出的多肽,它属于胰多肽家族,本实验通过检测盆底主韧带及阴道前壁组织中神经肽Y及其受体的表达情况,探讨神经肽Y及其受体表达与POP发生发展的相关性。材料与方法一、材料32例子宫脱垂患者的主韧带、膨出阴道前壁组织全层及17例非脱垂患者(宫颈癌Ib期)的主韧带及阴道前壁组织全层来自2008年1月到2009年10月中国医科大学附属盛京医院妇科手术切除的组织。标本采集均经医院伦理委员会批准及获得患者本人或家属的知情同意,并签署知情同意书。诊断标准依据1996年国际尿控协会公布的POP-Q分度标准,子宫脱垂Ⅰ度和Ⅱ度共16例,为A组；Ⅲ度和Ⅳ度共16例,为B组。所有组织平均分成两份,一份经福尔马林固定,常规石蜡包埋,另一份放入1.5ml Eppendorf管中液氮保存。二、方法：(一)免疫组织化学染色按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法行免疫组织化学染色。切片常规脱蜡,胃蛋白酶进行抗原修复,一抗4℃孵育过夜,DAB显色,苏木素复染。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：光镜下在每张切片中随机选取5个高倍视野,细胞间质棕黄色染色为阳性染色。(二)RT-PCR1、RNA的提取从液氮中取出标本,TRIzol法提取总RNA(按100mg组织加1mlTRIzol)。2、RT反应取已提取的RNA 1.25μl加入反转录反应液里进行反转录合成cDNA(反应体系为10μ1)。3、PCR扩增NPY-Y1引物：上游引物5’-CCA CTG ACC TCT ACA CCC AC-3’,下游引物5’-CCA GCA GGC TCC AAA G-3’;NPY-Y2引物：上游引物5’-AGG AGA CAG GAG CGA GTA-3’,下游引物5’-AAG GTA AAG CGA GTT CAG-3’;内参照物采用β-肌动蛋白(β-actin),上游引物5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’,下游引物5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。PCR反应体系扩增程序按以下条件设定：94℃40s,退火40s，72℃40s，35个循环。β-actin、NPY-Y1及Y2退火温度分别为55.5℃,52.5℃,50.7℃。所有基因扩增前94℃预变性3min,扩增后72℃延伸7min。4、电泳PCR产物各5μl经2%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察并拍照,进行图象分析。三、统计学分析应用SPSS13.0统计分析软件,NPY和POP临床病例特征的关系用卡方检验。A、B组及对照组三组之间NPY-Y1及Y2 mRNA的比较用单项方差分析,P<0.05为有统计学意义。脱垂组NPY-Y1及Y2 mRNA在主韧带及阴道前壁表达的相关性分别采用pearson相关分析。实验结果一、NPY在主韧带及阴道前壁组织中的表达情况各组患者主韧带主要由平滑肌细胞、纤维细胞和胶原成分构成,含有相当数量的血管、神经等。镜下可见阴道壁由表及里分别由粘膜层、肌层和外膜构成。粘膜由上皮和固有层组成,上皮为角化不明显的复层扁平细胞；固有层主要为结缔组织,其中可见平滑肌组织、小血管、毛细血管和小神经组织等结构。NPY在各组患者大部分主韧带及阴道前壁上均有分布,显微镜下观察,NPY主要在平滑肌细胞、胶原成分、纤维细胞中表达,并与血管关系密切。在脱垂组主韧带及阴道前壁组织中的阳性表达率分别为25.0%、34.4%,低于对照组分别为76.5%、70.6%(P=0.001、0.020)。在脱垂组主韧带及阴道前壁组织中,B组脱垂患者NPY表达低于A组,分别为12.5%VS50.0%，25.0%VS62.5%,统计学分析两组的差异有显著性(P=0.024、0.035)。二、NPY-Y1、Y2mRNA在主韧带及阴道前壁组织中的表达情况通过RT-PCR发现,NPY-Y1及Y2mRNA在主韧带及阴道前壁组织中均有表达。在主韧带中,脱垂组NPY-Y1 mRNA表达水平较对照组有升高趋势,差异有统计学意义(P=0.003)。A、B两组之间比较NPY-Y1 mRNA表达情况,差异无统计学意义(P=0.342),A组与对照组之间以及B组与对照组之间差异均有统计学意义(P=0.016，P =0.001)。脱垂组NPY-Y2 mRNA表达水平较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义(P=0.170)。A、B两组之间、A组与对照组之间以及B组与对照组之间比较NPY-Y2 mRNA表达情况,差异均无统计学意义(P=0.492，P=0.240,P=0.065)。在阴道前壁中,脱垂组NPY-Y1 mRNA表达水平较对照组有升高趋势,差异有统计学意义(P=0.012)。A、B两组之间比较NPY-Y1 mRNA表达情况,差异无统计学意义(P=0.861),A组与对照组之间以及B组与对照组之间差异均有统计学意义(P=0.013,P=0.008)。脱垂组NPY-Y2 mRNA表达水平较对照组有升高趋势,差异有统计学意义(P=0.002)。A、B两组之间以及A组与对照组之间比较NPY-Y2 mRNA表达情况,差异均无统计学意义(P=0.096,P=0.559)。B组与对照组之间差异有统计学意义(P=0.002)。三、NPY-Y1及NPY-Y2 mRNA表达的相关性对脱垂组中NPY-Y1及Y2mRNA进行pearson相关分析,结果显示：在主韧带组织中,r=0.415,P=0.018,提示NPY-Y1及Y2mRNA在脱垂组表达呈正相关,且相关度较大。在阴道前壁组织中,r=-0.216,P=0.235,提示NPY-Y1及’Y2mRNA在脱垂组表达无相关性。结论1、子宫脱垂患者主韧带及阴道前壁组织中的NPY参与了POP的发生、发展。2、子宫脱垂患者主韧带中NPY-Y1可能促进了子宫脱垂的发生。3、子宫脱垂患者阴道前壁组织中NPY-Y1及Y2可能共同促进了子宫脱垂的发生。4、子宫脱垂患者主韧带中NPY-Y1及Y2可能在子宫脱垂发生发展中有协同作用。