背景心梗后心室重构（Ventricular remodeling,VR）是指急性心肌梗塞（Acute myocardial infarction,AMI）后心脏在受到损伤或超负荷状态下,出现复杂的分子信号的改变和胚胎基因及蛋白的再表达,从而造成心肌细胞适应不良性肥大、心肌细胞凋亡和心肌细胞外基质纤维化,引起心室大小、形态、组织结构及功能形态等发生一系列的改变,在临床上表现为心室肥厚,心室容量的增加和心室结构的改变。心梗后心室重构进一步发展可导致心衰、猝死,是并发室性心律失常及充血性心衰甚至心源性死亡的最重要的危险因素之一。心肌细胞凋亡在心室重构中起着重要的作用,抑制凋亡可延缓心力衰竭的发展。过去认为,梗死区心肌细胞的死亡形式主要是坏死,而最近研究结果证实,有更多的心肌细胞是凋亡。研究发现细胞凋亡广泛存在于梗死区、非梗死区,其发生机制与机械应力、神经激素系统、炎症细胞因子、氧化物、一氧化氮等多种诱导凋亡刺激物密切相关,心肌凋亡的意义不仅在于扩大心肌梗死范围,亦触发启动心室重构。梗死区大量心肌细胞凋亡,心肌细胞数量急剧减少,心肌细胞间失去正常的紧密连接,局部室壁变薄,在内压作用下引起心肌细胞束间的侧向滑移,从而导致梗死区膨出,之后,各种因素导致非梗死区心肌细胞持续凋亡,心肌细胞产生侧滑移,导致左心室进行性离心性肥厚、扩张,非梗死区心肌细胞凋亡与晚期重塑互为因果,促进心功能不断恶化。5-LOX是催化花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）代谢的关键酶,能催化AA转化为白三烯。白三烯是许多炎症和过敏性疾病的重要介质,也被认为与心血管疾病密切相关[1]。局部缺血病人的白三烯合成增加,白三烯能导致粒细胞和单核细胞在血管内皮积聚和活化,损伤血管内皮细胞,增加血管渗透性,进一步加重组织缺血缺氧,促进细胞凋亡。目前对5-LOX途径的功能研究发现其在哮喘、动脉粥样硬化型心脏病及心肌缺血再灌注损伤等病理过程中发挥重要的作用。在动脉粥样硬化疾病中,人及ApoE-/-小鼠的动脉粥样斑块中均检测到5-LOX表达升高,敲除ApoE-/-小鼠5-LOX基因后可以显著降低粥样斑块的形成[2-4]。5-LOX基因多态性被认为与动脉粥样硬化高度相关,是动脉粥样硬化的发生的危险因素[5]。在心肌再灌注损伤中,RNA干扰5-LOX能抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞坏死[6]。此外,抑制5-LOX还能抑制肾脏及脑的缺血再灌注损伤[7,8]。可见,5-LOX在缺血性疾病诱导的细胞损伤中起了重要作用。细胞凋亡是由细胞内凋亡相关基因直接控制,受细胞外信号影响的有着复杂的分子调控机制的一种细胞死亡形式。近年的研究认为,急性心肌梗死（AMI）心肌细胞的死亡不但有坏死,还有凋亡的参与[9]。凋亡受多种基因调控,其中Bax和Bcl-2分别是促进抑制凋亡的基因[10]。关于Bax和Bcl-2蛋白在细胞凋亡中的相互作用,目前认为两者是一对正负调节因子[11],Bcl-2基因通过其表达产物Bcl-2蛋白和Bax蛋白形成二聚体来终止细胞凋亡的发生。少量Bax蛋白与低水平的Bcl-2蛋白即可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,从而终止细胞凋亡的发生,反之若Bax蛋白水平较高,则形成较多Bax同源二聚体,从而加速细胞凋亡的发生,Bax/Bcl-2蛋白比值增高促进细胞凋亡的发生,比值下降抑制细胞凋亡[12]。补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》是益气活血法的代表方,其重用黄芪为君,补元气使气旺血行,周流全身;川芎、赤芍、归尾为臣,养血行血;桃仁、红花为佐,破结散瘀;地龙为使,通利经络。广泛用于心脑血管病治疗[13]。我们以往的研究结果表明,补阳还五汤能显著改善左室结构及功能,抑制间质区胶原沉积,抑制心肌细胞凋亡,减少心肌纤维化。而心肌细胞凋亡在心梗后心室重构的发生发展中起到重要的作用。近期本课题组采用数字基因表达谱分析（Digital Gene Expression analysis,DGE）对结扎冠状动脉模型大鼠基因表达的变化进行研究。我们的前期研究发现:白三烯途径的重要调控分子5-脂氧合酶（5-lipoxygenase,5-LOX）、白三稀 C4 合酶（Leukotriene C4 synthase,LTC4S）、半胱氨酰白三烯受体 2（Cysteinyl leukotriene receptor 2,CysLT2R）表达显著升高。我们还采用DGE分析对补阳还五汤抗心梗后心室重构的作用靶点进行研究。发现补阳还五汤能抑制心梗后大鼠心肌5-LOX、LTC4S、CysLT2R的表达。因此我们推测5-LOX/CysLT2R途径可能是补阳还五汤的作用靶点。补阳还五汤抗心梗后心室重构、抑制心肌细胞凋亡的机制值得我们进一步研究。目的本研究旨在探讨补阳还五汤对心肌梗死后心室重构心肌细胞凋亡及5-LOX表达的影响。从而为心梗后心室重构的发病机制提供新的思路,为补阳还五汤防治心梗后心室重构提供新的作用靶点。方法1.大鼠心肌梗死模型制作与分组选用SPF级雄性Wistar大鼠,结扎左冠状动脉主干造成心肌梗塞模型。造模后1周将心梗模型大鼠随机分成3组:补阳还五汤组:补阳还五汤水煎液18.5 g/（kg·d）（生物等效剂量）灌胃;模型对照组、假手术组。假手术组和模型对照组予正常饮水。连续给药12周。于第12周末,水合氯醛麻醉大鼠,经腹主动脉注射10%KCl注射液处死,4%中性甲醛固定心肌。2.大鼠心肌组织TUNEL染色TUNEL染色:将切片脱蜡、水化,洗涤后吸去水分,加入反应液（TdT酶和-dUTP）反应,再次洗涤,用FITC反应液标记,经过PI复染后封片。镜下观察,凋亡细胞呈现出黄棕色。3.Western blot法检测心肌组织中相关蛋白表达在各组蛋白样品中加入上样缓冲液,10%SDS-PAGE电泳,转膜,脱脂奶粉封闭 60min,加入 5-LOX、Bax、Bcl-2、β-actin 多克隆抗体,4℃孵育过夜,1×TBST液洗涤3次,5min/次,加入二抗,37℃孵育90min,1×TBST液洗涤3次,5min/次。ECL化学发光试剂盒显色,Kodak全光谱多功能活体成像系统曝光。Image tool V3.0图像分析软件读取条带灰度值。实验重复3次。4.乳鼠原代心肌细胞培养及分组原代乳鼠心肌细胞经分离、纯化,用完全培养基（10%FBS的高糖IMDM）培养于孵箱中。心肌细胞培养的第3天,吸去原有培养基,改用2%FBS的IMDM高糖培养基配制药物分为以下5组:对照组（Control）:2%血清心肌细胞培养液培养24h后换液;H₂O₂组:2%血清心肌细胞培养液培养24h后添加终浓度l00μmol/L 的 H₂O₂ 作用 30min;低剂量（1mg/ml）、中剂量（2mg/ml）、高剂量（4mg/ml）补阳还五汤组:2%血清心肌细胞培养液预先添加上述剂量补阳还五汤培养24h后加入终浓度100μmol/L的H₂O₂作用30min。5.MTT法检测细胞活力MTT法检测不同浓度H₂O₂对心肌细胞活力的影响及补阳还五汤预处理对H₂0₂诱导的心肌细胞活力的影响。按照5×10³/ml浓度将细胞接种于96孔板,按实验分组给予相应处理因素。细胞处理完后,弃去培养液,加入IMDM培养液（100μL）和含0.5%MTT的培养液（10μL）孵育4h后,弃培养液,每孔加入DMSO 150μL,微孔振荡器上振荡10min使蓝紫色结晶甲瓒充分溶解,用酶标仪检测波长550nm处吸光度（OD值）。心肌细胞活力=干预组OD/对照组OD值×100%。活细胞数与OD值成正比。每组设5个复孔,取其平均值。实验重复3次。6.Annexin V-FITC/PI染色法检测补阳还五汤对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡心肌细胞按照实验分组处理后,用胰酶将贴壁细胞消化,收集悬浮液,250g离心5min,弃培养基;用冷PBS洗涤细胞两次;用400ul 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×105 cells/ml;在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC;轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15min。加入10ul PI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5min;在1h内用荧光显微镜检测,Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色。7.流式细胞术检测心肌细胞调亡心肌细胞按照实验分组处理后,用不含EDTA的胰酶消化收集,然后用PBS洗涤细胞 2 次（250g 离心 5min）,收集细胞,以 Annexin V-FITC/Propidium Iodide进行染色,室温、避光、反应15min,加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞,再加入5μL Annexin V-FITC于细胞悬液中,用移液器轻轻混匀,再加入5μL Propidium Iodide,轻轻混匀;室温、避光、反应5-15min,上流式细胞仪（激发波长488nm,发射波长530nm）进行检测。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FTTC通道（FL1）检测;PI红色荧光通过PI通道。使用未经调亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。分别计算调亡细胞及坏死细胞占总细胞的比率,实验重复3次。8.Western blot检测原代心肌细胞5-LOX、Bax、Bcl-2、GAPDH蛋白的表达心肌细胞按照实验分组处理后,RIPA裂解液提取心肌细胞中的蛋白,离心。BCA法测定提取上清液中的蛋白质浓度,在各组蛋白样品中加入上样缓冲液,其他步骤同前。9.统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差（x±S）表示,各组均数比较使用one-way ANOVA。方差齐时,组间比较用Bonferroni;方差不齐时,用Welch稳健估计,再用T3方法两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡结果镜下观察补阳还五汤组黄棕色凋亡细胞数量较模型组明显减少;补阳还五汤组细胞凋亡指数与模型组比较显著降低（P<0.01）。2.Western blot法检测心肌组织中相关蛋白表达结果模型对照组中5-LOX蛋白表达明显比假手术组升高。补阳还五汤治疗组与模型对照组相比,均可明显降低心肌梗死后心肌组织中5-LOX蛋白表达,且各组之间差异具有统计学意义。同样,Bax蛋白在心肌组织中表达与5-LOX呈现同样趋势。相反,补阳还五汤治疗组Bcl-2蛋白表达则较模型对照组升高。总的来说,补阳还五汤治疗后可以降低5-LOX蛋白表达;还可降低Bax蛋白表达,提高Bcl-2蛋白表达,从而提高Bcl-2/Bax比率。3.MTT法检测细胞活力MTT法检测不同浓度H₂O₂对心肌细胞活力的影响结果显示:各H₂O₂组的心肌细胞存活率较正常对照组明显下降;相同的作用时间下,随着H₂O₂浓度的上升,细胞的存活率呈下降的趋势;100μmol/L的H₂O₂刺激30min后心肌细胞的存活率降低程度适中,与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。MTT法检测补阳还五汤预处理对H₂O₂诱导的心肌细胞活力的影响结果显示:模型组细胞活性低于正常对照组;补阳还五汤低剂量组预处理后与模型组相比无差异（P>0.05）,中剂量组和高剂量组与模型组均有差异（P<0.01）。中、高剂量补阳还五汤能显著抑制H₂O₂诱导的心肌细胞活力降低,以高剂量组效果最佳,与H₂O₂组比较差异有统计学意义（P<0.01）。4.Annexin V-FITC/PI 染色实验结果显示,正常对照组中未见明显红、绿色荧光,H₂0₂组中绿色和红色荧光明显增多,不同浓度补阳还五汤治疗组中均出现不同程度的红、绿色荧光,程度较H₂O₂组减轻,且随着补阳还五汤浓度的增高,红、绿色荧光程度逐渐减轻,以补阳还五汤高剂量组程度最轻,提示补阳还五汤可以减轻H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡,以补阳还五汤高剂量组效果最好。5.流式细胞术检测心肌细胞凋亡结果采用流式细胞术分析心肌细胞的凋亡分布改变,结果发现,H₂O₂组心肌细胞凋亡率高于正常对照组;与H₂O₂组比较,补阳还五汤各剂量组心肌细胞凋亡率显著降低,呈一定的剂量相关性。6.Western blot检测心肌细胞蛋白表达H₂0₂组中5-LOX蛋白表达明显高于正常对照组,补阳还五汤各剂量组均能抑制H₂O₂诱导的心肌细胞5-LOX表达增加,具有剂量依赖性,与H₂0₂组比较差异有统计学意义（P<0.01）。H₂O₂组中检测心肌细胞Bax蛋白表达明显高于正常对照组,Bcl-2蛋白表达低于正常对照组。补阳还五汤各剂量组心肌细胞中Bax蛋白表达明显低于H₂O₂组,且Bax蛋白表达与补阳还五汤浓度呈反比,随着补阳还五汤浓度升高,Bax蛋白表达逐渐下降;补阳还五汤各剂量组Bcl-2蛋白表达明显高于H₂0₂组,（P<0.01）,且Bcl-2蛋白表达与补阳还五汤浓度成正比,随着补阳还五汤浓度升高,Bcl-2蛋白表达逐渐上升。结论补阳还五汤可抑制5-LOX的表达,并能下调促凋亡蛋白Bax的表达,上调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,提高Bcl-2/Bax比率,抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡。因此,我们认为,补阳还五汤可以保护心肌细胞,减轻心肌细胞凋亡,从整体—细胞—蛋白质不同层次干预心肌梗死后心室重构的病理过程,延缓心室重构的进展。