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第一部分重组慢病毒LV5-NE的构建及其在NB4细胞中的筛选目的:构建表达NE的慢病毒载体,在急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中过表达NE,并筛选纯的表达NE的NB4细胞株。方法:以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE的CDS区,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的含NE质粒与包装质粒(p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G)同时转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白对照组、NB4/LV5-NC组和NB4/LV5-NE组,荧光显微镜下观察慢病毒感染效率。慢病毒感染NB4细胞72小时后加入终浓度1μg/m L的嘌呤霉素(puromycin,PM)进行筛选;3天后减少PM的浓度至0.5μg/m L,并维持此浓度继续培养1周。RT-PCR和q RT-PCR鉴定NB4细胞中NE的表达;western-blot进一步鉴定NE是否表达。结果:酶切鉴定及测序结果表明成功构建重组穿梭质粒LV5-NE,同源重组成功,得到重组子LV5-NE;荧光显微镜显示病毒包装成功;经过五轮扩增后,病毒滴度达到3.0×108。慢病毒感染NB4细胞后,用PM进行筛选得到纯的NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE细胞;RT-PCR和q RT-PCR检测到NE在NB4细胞中表达(P<0.05);western-blot检测到NE蛋白在NB4细胞中表达(P<0.05)。结论:成功构建了携NE的慢病毒载体LV5-NE,并成功感染NB4细胞,筛选得到NB4/LV5-NC和NB4/LV5-NE细胞。第二部分LV5-NE对NB4细胞增殖、凋亡和PI3K/Akt的影响目的探讨NE对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4生物学效应和PI3K/Akt的影响,寻找NE致白血病的可能机制。方法实验分为空白对照组、LV5-NC组和LV5-NE组。慢病毒感染NB4细胞后,q RT-PCR检测基因NE的表达;Western blot检测蛋白NE的表达;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞仪测定NB4细胞周期和凋亡;q RT-PCR检测CCD1、FOX1、m TOR、RICTOR和PTEN基因表达;Western blot检测p Akt、Akt、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果在NB4细胞中过表达NE后与空白对照组和LV5-NC组相比:CCK-8提示NE明显促进NB4细胞的增殖作用(P<0.05);流式细胞术显示NB4细胞周期阻滞在S期和G2期(P<0.05),NB4细胞凋亡减少(P<0.05);q RT-PCR显示基因CCD1和FOX1表达上调,基因m TOR、RICTOR和PTEN下调(P<0.05);Western blot显示p Akt和Bcl-2表达增多(P<0.05)。结论NE在NB4细胞株中过表达后可促进NB4细胞的增殖抑制其凋亡,这一效应可能与PI3K/Akt通路中的基因和蛋白改变有关。第三部分NE对U937细胞中PI3K/Akt的影响目的:探讨在U937细胞中干扰NE后对细胞PI3K/Akt通路的影响。方法:si RNA-NE在脂质体2000的辅助下转染U937细胞,荧光显微镜观察转染效率;q RT-PCR检测基因NE表达是否下调;western-blot检测蛋白NE表达是否下调;q RT-PCR检测细胞CCD1、FOX1、m TOR、RICTOR和PTEN基因表达;western-blot检测p Akt、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果:荧光显微镜观察到si RNA-NE的转染效率达到95%以上;q RT-PCR结果显示基因NE表达下调(P<0.05);western-blot结果表明NE表达明显下调(P<0.05);q RT-PCR结果显示细胞基因CCD1和FOX1表达下调,基因m TOR、RICTOR和PTEN上调(P<0.05);western-blot结果显示磷酸化蛋白p Akt和抑制凋亡蛋白Bcl-2表达均减少,凋亡蛋白Bax表达增多(P<0.05)。结论:通过si RNA-NE成功下调U937细胞中NE的表达水平后,U937细胞PI3K/Akt通路基因和蛋白出现变化,这表明NE可能通过PI3K/Akt通路在U937细胞中发挥作用。