间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一种间质组织细胞，可以从不同的组织中分离得到如骨髓、骨骼肌、脂肪、脐带、循环系统、牙髓和羊水等，具有自我更新和多向分化的潜能，可诱导分化成骨、软骨、肌、脂肪和神经等多种细胞，在大鼠脑缺血区域或脊髓损伤区域移植MSCs能够促进其向损伤部位迁移并行使其修复功能。为了保证移植的MSCs由移植部位迁移到受损部位，且要保证迁移到损伤部位的细胞数量，这就需要研究调控细胞定向迁移的分子机制。研究发现HGF能够通过结合其受体c-met使β-catenin入核，从而激活Wnt/β-catenin信号通路促进细胞的迁移。而Dvl作为该信号通路的关键蛋白，参与调节HGF所诱导的肿瘤细胞的侵袭，本实验旨在研究Dvl对HGF诱导的MSCs定向迁移的作用机制。　　采用全骨髓法从SD大鼠骨髓中成功分离并在体外培养出高纯度的MSCs。用P3代以上细胞作为实验材料，提取MSCs的总RNA，RT-PCR克隆得到SD大鼠的Dvl以及其结构缺失突变体ΔDIX和ΔDEP的cDNA，利用AdEasyTM系统构建重组腺病毒载体Ad-Dvl、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP。构建成功的重组腺病毒在QBI-293A细胞中包装以及扩增，获得高滴度的病毒子，感染细胞以获得高表达Dvl、DIX和DEP的MSCs。同时针对SD大鼠Dvl基因由Abgent公司设计并合成FAM荧光标记的siRNA：FAM-siRNA，用脂质体转染MSCs降低Dvl的表达。为进一步检测Dvl在MSCs的定向迁移过程中的作用提供有利的工具。　　首先研究Wnt/β-catenin信号通路对MSCs迁移行为的影响。通过使用抑制剂DKK1和FH535以及激活剂LiCl和Wnt3a改变Wnt/β-catenin信号通路，采用Boyden chamber与Dunn chamber装置研究表明激活剂LiCl和Wnt3a促进了MSCs迁移，而抑制剂FH535降低MSCs的迁移能力，并能够阻遏Wnt3a和LiCl对细胞迁移的促进作用。Western blot表明Wnt3a和LiCl促进β-catenin的累积，而FH535能够抑制这一效应，说明激活的Wnt/β-catenin信号通路能够通过上调β-catenin调控MSCs迁移，但却发现抑制剂DKK1促进了MSCs的迁移，并略微增强Wnt3a促进的细胞迁移能力。据报道DKK1通过JNK调节细胞迁移，故此利用JNK的特异性抑制剂SP600125处理细胞，结果显示SP600125抑制DKK1对MSCs迁移的促进作用，同时发现DKK1能够增加JNK的磷酸化，这说明DKK1可能通过JNK介导的非经典Wnt信号通路调节MSCs的迁移。　　为了证明Dvl在MSCs的定向迁移过程中的作用，利用实时荧光定量PCR从mRNA水平检测MSCs中Dvl三种亚型的相对表达情况，数据显示MSCs中Dvl的三种亚型均表达，但是相对表达量不同，Dvl2表达量最高，Dvl1和Dvl3的表达量相对较低，仅仅占总Dvl表达量的10%。用Wnt3a、DKK1以及HGF处理后，Dvl三个亚型在mRNA水平上有较小的变化，这说明Wnt3a、DKK1以及HGF调节Dvl并不是在mRNA水平发挥作用的，可能是在蛋白水平或Dvl在胞内不同分布来发挥其生物学功能。　　最后利用siRNA降低MSCs中Dvl的表达以及Ad-Dvl感染MSCs高表达Dvl，通过改变MSCs中Dvl的水平，利用Dunn chamber和Boyden chamber装置检测MSCs的迁移变化，结果显示siRNA抑制了MSCs的迁移，并减弱MSCs向Wnt3a以及HGF定向迁移的能力，而高表达Dvl能够促进MSCs的迁移，并增强Wnt3a以及HGF对细胞迁移的趋化作用。为了进一步阐明Dvl对MSCs定向迁移的作用，利用Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP感染MSCs数据显示Ad-ΔDIX能够抑制Wnt3a以及HGF诱导的MSCs的定向迁移，但Ad-ΔDEP没有显著变化。Western bolt检测结果表明Ad-Dvl、Ad-ΔDEP能够增加β-catenin的表达，Ad-ΔDIX没有此效果，这说明Dvl通过DIX结构域激活Wnt/β-catenin信号通路调节MSCs的定向迁移。但Ad-ΔDEP降低了DKK1促进MSCs迁移的能力，而且DEP结构域调节JNK磷酸化。　　综上，Dvl通过上调β-catenin促进MSCs向Wnt3a以及HGF的定向迁移，当降低Dvl表达能够抑制Wnt3a以及HGF促进的MSCs定向迁移能力，而高表达Dvl通过激活Wnt/β-catenin信号通路增强Wnt3a以及HGF诱导的MSCs的定向迁移，在此过程中DIX结构域起着重要的作用。本实验为进一步揭示MSCs的迁移机制及临床应用MSCs进行干细胞移植提供了理论基础。