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目的：探讨姜黄素人工合成类似物联苯二氟酮(diphenyl difluoroketone，EF24)对体外培养的乳腺及卵巢肿瘤细胞生长、凋亡以及表达、分泌血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)的影响，并从氧化调节角度出发，研究氧化应激对上述两种肿瘤细胞体外分泌VEGF的作用，揭示姜黄素类似物EF24的氧化调节机制在抑制肿瘤血管生成过程中的调控作用。
方法：
⑴姜黄素(1-100μM)，EF24(0.5-30μM)分别作用于乳腺癌细胞MCF-7及卵巢癌细胞IGROV1，24及72小时后以MTS法(96孔板接种)或SRB法(24孔板接种)检测活细胞密度，绘出天然姜黄素及其合成物EF24对于各肿瘤细胞系的生长抑制曲线。应用原位末端转移酶标记技术(Terminal deoxynucleotidyl transferasedUTP nick end labeling，TUNEL)观察细胞凋亡的形态学改变；Western Blot检测细胞凋亡终末剪切酶caspase-3的活化以及凋亡拮抗蛋白Bcl-2的表达变化。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测培养液上清VEGF分泌水平，实时定量PCR检测细胞VEGF转录水平变化。
⑵在体外培养的MCF-7及IGROV1细胞系中，以过氧化氢模拟氧化应激，应用直接抗氧化剂N-乙酰丝氨酸(N-Acyty1-Cysteine，NAC)，间接抗氧化剂叔丁基氢醌(tert-butylhydroquinone，t-BHQ)以及姜黄素和EF24对细胞做预处理，检测培养液上清中VEGF分泌的变化。荧光探针标记肿瘤细胞，检测姜黄素及EF24处理后细胞内活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)的生成；以ROS清除剂超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)预处理细胞，观察EF24的细胞毒效应是否与ROS的水平相关。
⑶体外共转染抗氧化反应元件(Antioxidant Response Element,ARE)报告基因载体及内参照pRL-TK质粒，应用姜黄素及EF24治疗MCF-7及IGROV1细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual Luciferase Reporter assay,DLR)观察化合物基于ARE的抗氧化反应机制。分离核浆蛋白，Western Blot检测药物处理下核因子相关因子Nrf2的核内转位。
⑷应用瞬时转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术敲除ARE激活通路中的关键细胞转录因子Nrf2，降低其表达，观测姜黄素及EF24治疗对于Nrf2基因阻断的肿瘤细胞VEGF分泌的变化。
结果：
①姜黄素新型合成类似物EF24抑制乳腺及卵巢肿瘤细胞生长、促进其凋亡及降低VEGF蛋白分泌水平，EF24的半数抑制浓度远低于天然姜黄素。
②EF24可使肿瘤细胞致敏，增强化疗药物卡铂诱导细胞凋亡的效应，并能克服MCF-7细胞株对单药的耐药作用；
③EF24所介导的VEGF含量变化是在转录后水平进行调节的；
④过氧化氢可刺激肿瘤细胞VEGF的分泌，EF24可抑制由氧化应激引起的VEGF升高；
⑤EF24的细胞毒作用不依赖于活性氧自由基的生成；
⑥EF24可促进Nrf2核内转位，并激活抗氧化反应元件，这种效应呈剂量依赖性；
⑦肿瘤细胞经转录因子Nrf2基因阻断后，EF24无法激活ARE，且VEGF分泌水平与对照组相比无显著性差异。
结论：⑴新型姜黄素类似物EF24具有体外抗肿瘤效应，其生物活性强于天然姜黄素；⑵新型姜黄素类似物EF24体外通过激活抗氧化反应元件调节VEGF的表达和分泌；转录因子Nrf2在此通路中扮演重要角色。