论文部分内容阅读
肉毒毒素是肉毒梭菌产生的外毒素,是目前已知毒性最强的天然物质,共有七个血清型（AG）,其中A和B型是人类肉毒中毒的常见型别,同时也是一种重要的生物战剂。疫苗是预防肉毒中毒唯一有效的方法,肉毒毒素疫苗的研究对于军用和民用都具有重要的意义。本实验室前期工作已获得了A型肉毒毒素基于SFV复制子的DNA疫苗,但由于DNA疫苗诱导的免疫应答水平在人类中其效果还是较低,因此需要提高DNA疫苗的免疫原性以满足实际应用的要求。我们从以下几个方面对其进行了优化:通过信号肽研究抗原定位对免疫原性的影响,将不同类型的CpG免疫刺激序列引入载体骨架作为内源性佐剂;GMCSF基因佐剂通过三种不同方式进行递送;传统铝佐剂在新型DNA疫苗上的应用,并进行了免疫后抗体水平的长期检测,其中CpG、GM-CSF基因佐剂和磷酸铝佐剂都是首次报道在肉毒毒素DNA疫苗上进行应用。通过免疫小鼠后抗体水平、细胞免疫水平和细胞因子的检测,并最终通过攻毒实验确定了疫苗及佐剂的保护效果。本实验室前期实验结果表明A型肉毒毒素复制子DNA疫苗免疫的小鼠能够抵抗103LD50 A型肉毒毒素的攻击,采取优化策略后采用104LD50 A型肉毒毒素进行攻毒,结果表明经过C型CpG优化后的复制子DNA疫苗不但能够提高免疫小鼠后抗体水平,而且将攻毒后的存活率由25%提高到75%;GM-CSF基因佐剂与Hc基因共表达的SFV复制子DNA疫苗免疫小鼠后,将抗体滴度提高两倍,攻毒后存活率由25%提高到50%;磷酸铝佐剂与SFV复制子DNA疫苗混合后免疫小鼠后将抗体滴度提高4倍,攻毒后小鼠存活率由25%提高到75%,且免疫一年后仍具有保护作用,小鼠存活率为33%。以上实验证明了通过以上三种优化策略能够使原有SFV复制子DNA疫苗的免疫原性和保护作用不同程度的提高,通过观察抗体水平可至少持续一年,显示了优化策略的有效性及DNA复制子疫苗在A型肉毒毒素核酸疫苗研究中的良好的发展前景。另外三种优化策略可针对不同的抗原方便的应用于其它靶标疫苗的研究,使SFV复制子疫苗的研究平台进一步得到完善。肉毒毒素具有多个血清型,在A型肉毒毒素复制子DNA疫苗的基础之上,我们又构建了含有B型肉毒毒素Hc基因的复制子DNA疫苗,并进行了免疫原性的研究,该疫苗免疫小鼠三次后抗体滴度达到1:6400,用103LD50 B型肉毒毒素进行攻击,小鼠存活率为75%,结果表明SFV复制子系统具有应用于B型肉毒毒素DNA疫苗的潜力,为深入研究B型及多价肉毒毒素疫苗奠定了基础。炭疽杆菌（Bacillus anthracis）是一种能形成芽胞的革兰氏阳性菌,由它感染引起的炭疽病是严重危害人类的一种致死性的重大传染病,同时它又是一种潜在的生物战剂,炭疽疫苗的研究对于生物反恐具有重要的意义。PA是炭疽毒素的三大组分之一,是引起机体免疫应答的最有效的免疫原,单独应用没有毒性,当前应用的疫苗主要成分是PA。为了使疫苗更安全,同时缩短免疫时间,简化免疫程序,提高保护率,DNA疫苗是炭疽疫苗研发的一个重要方向。由于PA在炭疽免疫中的重要作用,目前大多数新炭疽疫苗的研究还是集中于PA或PA组分上,我们克隆了PA抗原的第四结构域基因,构建了炭疽PA4基因的SFV复制子DNA疫苗,这是SFV复制子系统首次应用于炭疽疫苗的研究。该疫苗免疫小鼠后具有良好的免疫原性,免疫三次后抗体滴度达到1:25600。随后将CpG内源性佐剂的优化方案应用于炭疽PA4复制子DNA疫苗,三种不同类型的CpG优化后的DNA疫苗免疫小鼠后能将抗体滴度提高2-4倍,具有良好的佐剂效果。同时由于重组病毒颗粒疫苗具有很好的应用前景,已有进入临床试验的报道,我们又首次进行了基于SFV复制子的炭疽重组病毒颗粒疫苗的研究。基于SFV复制子的DNA疫苗既可以单独使用,又可以与辅助系统共同转染细胞,经过制备和纯化可得到病毒滴度为107-8U/ml的重组病毒颗粒,经负染色在透射电镜下可见均一的病毒颗粒形态。含有PA4基因的重组病毒颗粒疫苗在体外可高效感染细胞,免疫小鼠后能产生特异性的抗体和细胞免疫反应,在免疫三次后能够产生滴度为1:102400的高滴度抗体,极有潜力作为人用炭疽候选疫苗,为进一步研究新型炭疽疫苗的研究奠定了基础。总结以上的实验结果,本研究采用了三种优化策略对肉毒毒素SFV复制子DNA疫苗进行了有效的优化,并在A、B型肉毒毒素Hc基因及炭疽PA4基因的SFV复制子DNA疫苗和重组病毒颗粒疫苗上取得了较好的结果和进展,不仅为下一步深入研制肉毒毒素和炭疽新型疫苗奠定了良好的基础,同时也为多价疫苗的研究及其他毒素、细菌和病毒等疫苗的研究提供了技术平台。