间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种中胚层来源的成体干细胞,在适宜的条件下可分化为神经细胞、肌肉细胞、成骨细胞以及成脂肪细胞等中胚层或其他非中胚层来源的细胞。MSCs分布广泛,在骨髓、牙髓、脂肪、外周血中都能够分离出来。在组织损伤修复中,损伤部位可分泌一些趋化因子,诱导MSCs定向迁移到损伤部位,并通过增殖、分化、分泌抗炎因子等方式促进组织修复。因为MSCs具有来源广泛、易于培养、免疫原性较弱、具有分化潜能以及不涉及伦理道德问题等特点,因此具有巨大的临床运用前景,其在组织损伤修复上的作用及机理已成为近年来的研究热点。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种广泛存在的基质蛋白和细胞因子,在干细胞壁龛(Niche)的维持、细胞的迁移与侵袭、癌细胞干性的维持、癌细胞凋亡的抑制及干细胞归巢等生理过程起非常关键的作用。研究表明,MSCs可响应损伤部位分泌的OPN发生定向运动,因此研究OPN影响MSCs运动能力的规律及其机理有助于揭示MSCs参与组织损伤修复的调控机制。细胞的运动在胚胎发生、伤口愈合、癌细胞的转移等生理过程中起关键的作用,其与细胞骨架重构、细胞-基质粘附、细胞以及细胞核力学性质有关,其中细胞核的硬度、变形性等力学性质决定了3D模型中细胞运动速度和效率。细胞的侵袭是依赖基质纤维水解的运动方式,其中有基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)的参与。包括OPN在内的多种生化因子可通过一定的信号通路影响MMPs的表达,从而影响细胞的侵袭。尽管细胞迁移和侵袭的机制以及作用的理论比较透彻,但这方面的实验研究主要集中在癌细胞上,目前对MSCs的运动能力相关机理的研究还不是十分充分。鉴于MSCs运动能力和OPN存在广泛联系,且MSCs具有巨大的干细胞医疗运用前景,本文从信号转导和细胞核力学特征两方面探讨OPN影响MSCs运动能力的机制,以期为推动MSCs的临床应用提供研究数据参考。本文主要研究内容和结果如下:1.MSCs的分离、培养和鉴定本文采用差时贴壁法分离培养大鼠MSCs。结果发现,所得的细胞个体形状大致呈长梭形,折光率高;群体形态呈漩涡形。采用流式细胞术分析表面抗原表达情况,结果表明,培养分离的细胞表达CD90、CD44,而不表达CD34。细胞形态学观察和流式细胞术分析检测结果提示,所得的细胞符合间充质干细胞的一般特征。2.OPN对MSCs运动能力的影响本文采用transwell小室法检测OPN对MSCs运动能力的影响,结果发现,OPN作用下MSCs没有明显的增殖现象,但是其迁移和基质胶侵袭能力却显著加强,提示OPN可以增强MSCs的运动能力。Western blot检测结果显示,OPN处理能够有效提高FAK和ERK1/2分子的磷酸化水平,而FAK抑制剂PF573228或ERK1/2抑制剂PD98059处理均能有效下调OPN诱导的细胞迁移和侵袭,提示OPN通过激活FAK和ERK1/2促进MSCs的迁移和侵袭。使用明胶酶谱实验检测MMPs活力发现,OPN可显著增强MMP2活性,但对MMP9的活力没有显著影响;另外,PD98059和PF573228处理能下调OPN诱导的MMP2活性,提示OPN可能通过FAK、ERK1/2影响MMP2的活性,进而影响MSCs的侵袭。3.OPN对MSCs细胞核力学特征的影响为了验证细胞核力学特征变化在OPN诱导的细胞运动能力中是否有作用,本文使用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)检测细胞核硬度变化,结果表明,OPN处理能够有效地降低MSCs细胞核的杨氏模量。使用PD98059或PF573228处理MSCs能显著恢复OPN诱导的细胞核硬度降低,提示FAK和ERK1/2介导了OPN对细胞核硬度的调节。细胞核骨架蛋白LaminA/C是影响细胞核硬度的主要因素。使用RT-PCR和Western blot检测OPN对laminA/C蛋白表达的影响,结果表明OPN的处理无论在mRNA水平上还是在蛋白质水平上都能显著降低LaminA/C的表达。进一步使用PD98059或PF573228处理细胞以阻断ERK1/2或FAK的磷酸化激活发现,两者均能够增加OPN降低的LaminA/C表达。这些实验结果表明,OPN通过FAK和ERK1/2降低LaminA/C表达,而LaminA/C的下调有可能是细胞核杨氏模量变化的原因。综上所述,本文研究结果表明,OPN通过FAK、ERK1/2影响MSCs的迁移,通过FAK、ERK1/2和MMP2影响MSCs的侵袭,并且OPN可能通过FAK、ERK1/2降低LaminA/C表达,降低MSCs细胞核硬度,从而提高MSCs的运动能力。