目的弓形虫表面抗原1（surface antigen1,SAG1）在弓形虫速殖子期表达,目前已知其主要功能是协助速殖子侵袭宿主细胞和诱导宿主产生免疫,本研究的目的是筛选宿主细胞中与弓形虫SAG1相互作用的蛋白,探索发现SAG1新的功能,同时为SAG1侵袭宿主细胞的分子机制研究奠定基础。方法根据已知的SAG1基因序列设计特异性引物,以弓形虫GT1株全基因组为模板PCR扩增SAG1基因片段,克隆到p MD18-T载体,经双酶切鉴定后测序,将测序正确的目的基因片段克隆到p GEX-4T-1载体质粒中,构建原核表达载体p GEX-4T-1-SAG1,将测序正确的原核表达载体转化至BL21感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,采用盐酸胍变性与梯度透析复性方法进行蛋白纯化,以GST标签单克隆抗体和SAG1单克隆抗体为一抗进行Western Blot验证。通过GST pull-down技术,以纯化后的重组蛋白SAG1为诱饵蛋白,分别与人肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Hep G2）和人肠癌细胞（HCT116）进行互作蛋白筛选,并对下拉蛋白进行质谱分析,筛选与SAG1互作的宿主细胞蛋白。对蛋白质谱鉴定结果进行分析,选择其中具有重要生物学意义的互作蛋白进行验证。设计带有Flag标签的引物,采用PCR方法扩增获得SAG1基因片段,构建真核表达载体pc DNA3.1（+）-Flag-SAG1,经双酶切鉴定后测序,将测序正确的质粒转染至人胚胎肾上皮细胞（293T）中,采用免疫共沉淀、GST pull-down和免疫荧光3种技术方法进行互作蛋白的验证。结果本实验通过PCR扩增获得弓形虫GT1株的SAG1基因片段,大小为1011 bp,构建原核表达载体p GEX-4T-1-SAG1,阳性质粒经双酶切后获得约4969 bp和1011bp两条预期条带,插入片段测序结果为1011 bp,与预期结果一致。经IPTG诱导,成功表达重组蛋白SAG1,分子量大小为63 k Da（含GST标签蛋白）,纯化后的重组蛋白经Western Blot验证,能够被GST抗体和SAG1抗体特异性识别。下拉蛋白经质谱分析发现,重组蛋白SAG1与人肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Hep G2）和人肠癌细胞（HCT116）存在相互作用的细胞内源性蛋白分别有36、24、28个（唯一肽段数≥2）。采用韦恩图统计方法分析发现,3种宿主细胞共有的互作蛋白有13个,分别为KPYM、G3P、HS90B、TBB5、RL7、RL18、ENOA、HNRPU、LDHA、RACK1、GSTM3、GSTP1和ATPA。采用免疫共沉淀、GST pull-down和免疫荧光3种方法对重要的支架蛋白RACK1进行验证。将Flag-SAG1转染至293T细胞,进行免疫共沉淀实验,用RACK1抗体为一抗进行Western Blot验证,在32 k Da位置有预期的RACK1蛋白条带,证实SAG1和RACK1存在相互作用;通过GST pull-down再次验证SAG1与RACK1存在直接相互作用;重组质粒p EGFP-N1-SAG1和m Cherry-RACK1共转染293T细胞,荧光显微镜观察显示SAG1和RACK1共定位于细胞质。结论1、采用GST pull-down串联质谱分析技术,发现重组蛋白SAG1与人肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Hep G2）和人肠癌细胞（HCT116）存在唯一肽段数≥2的相互作用的细胞内源性蛋白分别有36、24、28个。结合韦恩图统计方法分析发现,3种宿主细胞共有的互作蛋白有13个,分别为KPYM、G3P、HS90B、TBB5、RL7、RL18、ENOA、HNRPU、LDHA、RACK1、GSTM3、GSTP1和ATPA。2、采用免疫共沉淀、GST pull-down和免疫荧光3种方法验证了弓形虫SAG1与RACK1存在直接相互作用。