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目的：1.研究浙江汉族人群中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者线粒体基因组ND2基因区域内核苷酸位点多态性变异的发生情况.2.分析ND2基因变异与T2DM主要临床指标及其并发症的关系,探讨线粒体ND2基因检测对于T2DM的诊断价值.
方法：1.随机选择220例来自中国浙江无血缘关系确诊为T2DM的汉族患者,详细记录每例患者的临床资料及主要生化指标.同时选择无高血压、高脂血症、心脑血管疾病、肾病、糖尿病及家族史,口服葡萄糖耐量正常的健康体检者116名作为正常对照.2.提取研究对象的外周血总DNA,设计三对引物,通过聚合酶链反应扩增线粒体.DNA,纯化PCR.产物,对产物进行直接测序,利用片段重叠群拼接线粒体ND2基因,与线粒体基因剑桥参考序列(Cambrige reference sequence,CRS)比对找出线粒体ND2基因的核苷酸变异位点.3.分析T2DM组ND2基因变异位点,并比较T2DM组与正常对照组各个变异位点的发生率,探讨ND2基因变异与T2DM的关系.4.将T2DM患者分成有有家族史组和家族史异组,分析ND2基因变异与T2DM遗传的相关性.5.对T2DM组发生ND2基因变异的病例分别按照有无高血压、.肾病、视网膜病变和周围神经病变进行分组,探讨ND2基因变异与T2DM并发症的关系.
结果：1.T2DM患者组和正常对照组与标准序列比对存在着大量的基因变异位点,具有线粒体基因组的多态性.在220例T2DM患者中发现ND2基因43个变异位点,116份正常对照中也有38个变异位点,其中26个位点既存在于T2DM患者人群,也存在于正常对照人群.经统计学分析,A5351G位点的变异在两组间的分布具有统计学上的差异,P值0.043,其余所有位点在两组间的分布均无统计学意义,推测大部分是一些多态性改变.
2.T213M患者中出现的43个变异位点中32个位点在www.mitomap.org中已有报道,对基因变异后编码的氨基酸分析发现,31个为同义突变,12个为错义突变,其中9个同义突变和3个错义突变在以前的文献中未曾报道.分析这12个错义突变,发现有6个变异(T4549G、.A4824G、.A4833G、C5178A、G5460A和A5466G)导致了编码氨基酸极性的改变,3个变异(T4549G、F4768C和A5466(G)导致ND2亚单位二级结构的改变.对这12个错义突变在不同物种间进行保守性分析,它们都不是进化上的保守位点,推测为多态性现象.
3.A4769G变异率高达100﹪,在全部220例T2DM患者与116例正常对照者中均检出A4769G变异.无论是T2DM组还是正常对照组,C5178A的改变总是伴随着的C4883T改变;G5460A的改变总是伴随着A5351G的改变.在T2DM组与正常对照组中,其检出率分别为C5178A:21.8﹪/13.8﹪,C4883T:23.2﹪/15.5﹪,G5460A:5.4﹪/3.4﹪,A5351G:6.8﹪/1.7﹪,其中C5178A与G5460A为错义突变,A5351G与C4883T为同义突变.
4.把142例有变异点的T2DM患者分为有家族史和无家族史,并作统计学分析,发现A4715G在两组间分布有统计学意义(P=0.001),在有家族史组中出现率远远高于无有家族史组.有家族史组与无家族史组比较:有家族史组女性患者发病率明显升高,病程延长,糖化血红蛋白(HbAlC)与空腹血糖(FBG)值均高于无家族史组,并且更容易引起视网膜病变,周围神经病变及肾病等并发症(P≤0.05).
5.把T2DM组检测到的ND2基因变异结合并发症分析.G5417A位点的变异只出现在无并发高血压的患者中,在有、无高血压两组中的分布具有统计学差异(P=0.03).T4561C和T4768C这两个位点仅存在于有肾病组并且发生了错义突变,但各只有1例在有、无肾病两组中的分布均无统计学差异(P>0.05).T4768C位点仅存在于有视网膜病变组并且发生了错义突变,但仅有1例且在两组间无统计学差异(P>0.05).T4768C位点只存在于有周围神经病变组并且发生了错义突变,但均为1例且在两组中的分布均无统计学差异(P>0.05).
6.按并发症分组分析各组间主要临床资料的差异.发现并发高血压组的发病年龄要高于无高血压组;并发肾病的组与无肾病组相比,平均发病年龄提前,病程延长,空腹血糖(FBG)升高、总胆固醇(TC)升高、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)升高;并发视网膜病变组比无视网膜病变组病程延长;有周围神经病变组与无周围神经病变组相比,糖化血红蛋白(HtbAlC)及餐后2小时血糖(P<,2>BG)升高(P≤0.05).糖尿病并发肾病,视网膜病变,周围神经病变三者问有密切关系,三者均为糖尿病微血管并发症,这三者之间相互作用,相互影响.
结论：1.线粒体ND2基因区域存在大量变异位点,且绝大部分只是基因的多态性.
2.线粒体ND2基因的T4549C、T4561C、T4768C、C5178A、A5319G、A5351G、G5460A和A5466G等变异可能与浙江汉族人口中T2DM的发生发展相关,有待于进一步深入研究.
3.线粒体ND2基因变异位点可能与T2DM的临床表现与并发症及家族遗传特性密切相关,对T2DM患者要关注T4561C、A4715G和T4768C等位点的变异,对于了解T2DM临床特征,判断预后,早期预防并发症,减少T2DM的致残率和死亡率都具有重要意义.
4.浙江汉族人群较常见的线粒体ND2基因多态性变异有A4769G、C4883T和C5178A.线粒体ND2基因nt4769碱基G可成为今后浙江汉族人线粒体基因研究的正常参考.