目的上皮细胞向间充质的表型转化(EMT)是肿瘤发生发展的重要环节,E-钙粘素是EMT转化的关键分子指标,然而对它的调控机制还有待进一步认知。EPSH蛋白是一种具有ATP酶活性的运输蛋白,EPSH可以通过调控细胞膜上胞膜窖的脱落及其随后的内吞过程来调控膜蛋白在细胞膜上的分布,EPSH首先结合到细胞膜上然后发生寡聚化,当需要调控细胞膜上蛋白质的细胞运输时,会从膜上分离并完成其调控作用。在这个过程中,ATP的结合与水解起到重要调控作用。因此EPSH通过其ATP酶活性调节细胞的膜内吞及物质运输。本研究围绕EPSH的转运调控特性,探讨其对E-钙粘素的调控机制,以及在乳腺肿瘤恶性转化中的作用。方法1、应用慢病毒系统建立T47D稳定表达细胞系。Transwell实验及愈合实验检测EPSH及其ATP酶突变对于细胞迁移及侵袭的影响。Western blot检测EPSH及其ATP酶突变对E-钙粘素表达及其细胞定位的影响。2、Western blot检测EPSH及其ATP酶活性突变体对E受体表达及其细胞定位的影响。3、Western blot检测EPSH及其ATP酶活性突变体通过E受体对E-钙粘素转录负调控分子的影响。4、检测EPSH及其ATP酶活性突变体通过E受体对E-钙粘素降解的影响。5、检测在E受体活化下,EPSH及其ATP酶突变体对E-钙粘素表达水平的影响。同时利用不同的抑制剂加以验证。6、利用慢病毒感染4T1细胞,构建稳定表达细胞系,应用SCID鼠研究体内成瘤作用。结果1、根据Western blot检测的结果显示:构建的T47D细胞系稳定过表达EPSH及其突变体。WT组相对Vector组E-钙粘素表达水平降低,失活性突变组E-钙粘素相对于WT组下降更为明显,活化突变组E-钙粘素表达水平上调。免疫荧光实验结果显示WT组及失活性突变组中E-钙粘素趋于核周分布,活化性突变组中E-钙粘素主要分布在细胞膜。2、T47D细胞过表达EPSH后E受体表达量上调,失活性突变组E受体升高更为显著。活化性突变组E受体表达下调。免疫荧光实验结果显示WT组及失活性突变组中E受体与EPSH在膜上存在共定位,而活化性突变组中E受体形成囊泡与EPSH在胞浆中存在共定位。3、Western blot检测发现WT组及失活性突变组中E受体表达量上调,E-钙粘素表达量降低,间质指标Vimentin的表达量升高,E-钙粘素的转录抑制因子Slug的表达量升高,细胞迁移和侵袭能力增强,活化性突变组中E受体表达量下调,E-钙粘素表达量升高,间质指标Vimentin的表达量降低,Slug的表达量降低,细胞迁移和侵袭能力减弱。4、在蛋白合成抑制剂作用下,WT组及失活性突变组中E受体的降解速度减慢,而E-钙粘素降解速度加快,活化性突变组中E受体的降解速度加快,E-钙粘素的降解速度降低。5、撤钙后,Western blot检测E-钙粘素明显下降,E受体表达量也明显下降,撤钙早期可检测到活化的E受体。6、撤钙3h同时利用生长因子激活E受体信号通路后,E-钙粘素的降解增强,WT组及失活性突变组E-钙粘素降解更快,活化性突变组中E-钙粘素降解相对较慢。7、撤钙3h同时应用抑制剂AG1478阻断E受体通路后,E-钙粘素降解速度减缓,WT组及失活性突变组中E-钙粘素的降解更慢,活化突变组中E-钙粘素降解相对较快。8、免疫荧光实验发现撤钙后E受体形成囊泡,WT组和失活性突变组E受体主要分布在膜上,而活化性突变组中E受体形成的囊泡主要分布在胞浆中。9、体内成瘤实验结果显示,过表达EPSH促进4T1细胞在小鼠体内成瘤,相对于WT组,失活性突变组成瘤性更强,活化性突变组成瘤性较弱。结论1、EPSH及其ATP酶活性突变体影响E受体的稳定性,过表达EPSH及其失活性突变增强E受体的表达,EPSH活化突变促进E受体内吞。2、EPSH及其ATP酶活性突变体通过E受体调控细胞内E-钙粘素的表达。3、EPSH通过其ATP酶活性调控肿瘤细胞增殖、迁移以及小鼠体内成瘤性。