论文部分内容阅读
蝗虫微孢子虫(Nosema locusta)属单细胞原生动物,是直翅目昆虫中蝗虫的专性寄生物。蝗虫微孢子虫在蝗虫防治实践中可诱发虫病流行起到持续性压低种群密度的效果,作为一种昆虫病原微生物具不污染环境、对人畜无毒等优点,从而使得对蝗虫微孢子虫的致病机理研究及防治应用成为研究的重点。微孢子虫(microsporidia)的孢壁是与宿主最先直接接触的部分,其中的孢壁蛋白(spore wall protein)在感染宿主的过程中扮演着重要的角色,因此孢壁蛋白成为微孢子虫研究的热点。目前报道的微孢子虫孢壁蛋白有13种,但其作用机制及具体的功能尚不清楚。本研究在已鉴定出的5种蝗虫微孢子虫假定孢壁蛋白的基础上,选取其中1种假定孢壁蛋白(ALSWP2)进行了研究,包括序列特征及转录分析、基因克隆及原核表达、该蛋白的功能以及侵染和增殖过程中的作用进行了初步的探讨,为蝗虫的生物防治提供作用靶标和理论基础。主要研究结果如下:1. ALSWP2的序列分析及转录分析运用生物学软件和在线预测方法进行初步分析,发现它的大小约23KD,N-糖基化位点有两个,O-糖基化位点有一个,并且在N端有XBBXBX基本类型的肝素结合位点,与其他微孢子虫蛋白比较,4个半胱氨酸的位置也是很保守的。对蝗虫微孢子虫ALSWP2进行转录分析,结果表明,ALSWP2基因在蝗虫微孢子虫和蝗虫体内均表达。2. ALSWP2的基因克隆、原核表达及纯化在序列分析的基础上,对ALSWP2进行克隆,并对带有His标签的pET28a-ALSWP2重组蛋白进行纯化。经IPTG0.1mM、0.5mM、1mM浓度于30℃条件下诱导2小时、4小时、6小时、8小时,确定目的蛋白表达量最多的诱导条件,最终采用30℃,IPTG0.1mM浓度诱导4小时,超声波破碎得到目的重组蛋白,再用Western blotting法检测,结果表明该蛋白的抗血清特异性强,与蝗虫微孢子虫的其他蛋白质无交叉反应,具有物种的特异性。3. ALSWP2的功能初探RNAi试验对ALSWP2基因的功能初探RT-PCR扩增结果显示,未采用RNAi的蝗虫在接种微孢子虫后第七天可以检测到转录本,而采用RNAi的蝗虫在接种第三天就可以检测到转录本,表明RNAi加快了微孢子虫的侵染能力,说明ALSWP2基因具有抵御蝗虫微孢子虫的侵染功能,与蝗虫的免疫能力相关联。