棉花(Gossypium hirsutum L.)作为全世界重要的经济作物之一,其纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源,种子中有重要的油料和蛋白质资源。全球棉花总播种面积是3460万hm2,皮棉总产2345万t,平均单产747kg/hm2(中国棉花信息网,2012年)。棉花生产稳定与否,直接关系到整个农业生产、农民收入和纺织工业的发展。各种非生物逆境(高盐、干旱、低温和高温)对植物尤其是作物的生长和发育有着非常重要的影响,目前非生物逆境对作物的影响已成为许多地区农业发展的瓶颈。棉花体细胞胚胎发生是一个棉花细胞响应逆境胁迫的过程,该阶段基因差异表达反映了棉花应对逆境的能力,因此对来自该阶段有差异表达基因进行克隆和功能验证研究,对提高棉花对干旱和高盐等逆境耐受能力的研究具有重要意义,为棉花利用基因工程手段创新资源和培育出更多高产、优质、抗逆的新品种,提供相关理论基础和物质基础。本研究基于棉花体胚发生RNA-Seq表达谱数据,克隆到早期优势表达的基因GhCIPK6,分别在拟南芥、棉花中进行超量表达或干涉表达,在干旱、高盐以及脱落酸(ABA)等条件下详细进行功能鉴定,主要结果如下：1、GhCIPK6的克隆及生物信息学分析GhCIPK6基因来自本实验室2011年的棉花体胚发生RNA-Seq表达谱中633 bp的EST序列(zhul_Ghi# S42301775),通过5’和3’RACE得到一个1681bp cDNA克隆,其中5’、3’非编码区序列长度分别为113 bp、272 bp,开放阅读框(ORF)为1296 bp,编码431个氨基酸,分子量为48.46 kD,等电点值pI值为9.12；经c DNA和g DNA序列比对,该基因内部无内含子。系统进化分析及氨基酸比对等生物信息学分析结果表明,该基因与拟南芥26个CIPK中AtCIPK6同源,因此命名为GhCIPK6 (GenBank accession number: KC465063)。该基因编码与CBL互作的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有与所有的CIPK基因相似结构,由两部分组成：N端含有SNF1-相关的丝氨酸／苏氨酸激酶域,C端存在与CBL互作的NAF/FISL结构域。NAF/FISL结构域可以与CBL结合,通过N端丝氨酸／苏氨酸激酶域磷酸化下游的基因传递信号,在C端还有与PP2C蛋白磷酸酶互作的PPI motif。2、GhCIPK6基因组织表达和非生物胁迫表达分析通过RT-PCR和qRT-PCR分析GhCIPK6组织表达模式,该基因除了在棉花纤维中不表达外,在多种组织中均有表达,其中在开花当天的花药中表达丰度最高；在三周大幼苗叶片中表达较根中表达高；该基因在棉花体胚发生过程中差异表达,其中在脱分化早期表达丰度较高。在NaCl(200 mmol/L)、PEG(15%)和ABA(100¨μmol/L)等模拟的非生物胁迫和激素处理下,该基因在根和叶组织中均被诱导上调表达,叶片的表达相对滞后于根中的表达。3.GhCIPK6基因启动子分析及蛋白的亚细胞定位通过Genome-Walking技术扩增到GhCIPK6起始密码子上游568 bp的启动子片段,经PLACE在线分析,该启动子区段有花粉粒特异表达及逆境胁迫诱导基因的顺式作用元件。该序列融合GUS基因,并转化棉花,在棉花种子萌发早期的子叶和种子根尖有染色,开花当天的花药染色较深,成熟叶片、苞叶、雌蕊子房及柱头中均未染色；GhCIPK6融合GFP蛋白瞬时转化棉花胚性愈伤原生质体,结果显示该蛋白定位于细胞膜上。4、拟南芥中超表达GhCIPK6提高转基因植株的耐盐性并降低对ABA的敏感性。在拟南芥中超表达GhCIPK6,转基因系在种子萌发和幼苗生长期均具有耐盐性,与野生型比较萌发快且发芽率高；在0.5-1 μmol/L浓度ABA处理下,转基因拟南芥萌发快,根长显著比野生型长,表现为对ABA不敏感。5、拟南芥中超表达GhCIPK6增强转基因植株的抗旱性,并激活相应AtCBL1/ GhCIPK6-AKT2信号路径GhCIPK6超表达拟南芥转基因植株在干旱处理情况下,表现抽薹早于野生型,复水后存活率和株高显著高于野生型。对超表达系和野生型在干旱处理与正常条件下对钙信号通路、钾离子通道、ABA信号通路的相关基因表达分析显示,(GhCIPK6与AtCBLl和AtCBL4互作构成钙信号网络,干旱胁迫下激发钾内流基因上调表达、而钾外流基因下调表达；同时ABA路径中干旱响应标记基因RD22、RD29A和DREB2A在转基因系上调表达。6、超表达GhCIPK6增强棉花转基因植株对高温的敏感性构建GhCIPK6超表达和RNAi载体,遗传转化棉花品系YZl,分别得到超表达和干涉的转基因纯系,田间T3代花器官比较结果,超表达系花器官、子房、胚珠均变大,花柱变长；而两个干涉系则相反。超表达棉花T3纯系在田间高温时(8月20日前),开花当天花药表现为花丝短小,花药不开裂、柱头长,扫描电镜和光学显微镜观察结果,花粉粒小、瘪、部分没有刺突；I2-KI染色为无色,表现典型的不育症状。9月以后出现可育,部分结铃。通过HPLC-MS分析这两个时期棉花花药的激素变化,在正常温度下,所有棉花材料均可育,但在GhCIPK6超表达材料中IAA含量显著高于野生型和干涉材料,JA和ABA则显著低于野生型和干涉材料,在高温情况下,超表达系表现高温不育,野生型和干涉材料可育,超表达材料中IAA含量相对于正常温度下含量急剧下降,ABA含量也降低,高温可能导致IAA在超表达系的花药中的合成和运输受到抑制,导致花粉粒发育受阻,GhCIPK6可能正调控生长素的积累,导致超表达转基因植株对高温的敏感性,导致花药败育。