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具有遗传毒性的化学致癌物，可直接或间接地对细胞内DNA造成损伤从而影响整个基因组的稳定性，因此针对环境中遗传毒性化合物的检测，建立高灵敏、高通量检测系统对环境风险评估以及癌症预防都具有重要地现实意义。面对环境中遗传毒性化合物剂量浓度低、毒性作用类型繁复等问题，亟待发展应用广、操作简单、标准化分析的高灵敏度、高通量遗传毒性化合物检测技术。本研究构建基于酵母DNA损伤响应的超灵敏遗传毒性快速检测体系作为特异型环境遗传毒性检测效应生物标志物，并利用高通量技术手段在酵母全基因组范围内筛选影响该生物标志物对遗传毒性检测效应的易感基因群，为环境致癌风险评估提供一种新型检测技术。本论文的研究工作包括以下内容:
1.建立两种基于酵母DNA损伤响应的遗传毒性化合物新型检测系统。
此前本实验室与合作导师萧伟教授实验室发展了基于酵母DNA损伤响应遗传毒性检测系统RNR3-lacZ，并通过对宿主酵母细胞进行遗传改造以提高该检测系统的应用灵敏度，这些研究成果均为本研究的开展奠定了坚实的基础;但是由于lacZ作为检测系统的报告元件存在一定的缺陷，即测定β-半乳糖苷酶活力时，需要破碎细胞，这一过程中影响酶活反应的因素复杂并且人为试验重复性差，因而不利于RNR3-lacZ检测系统在实际中的应用。本研究欲在RNR3-lacZ检测系统的基础上进行改进，建立一种高通量、高灵敏度的新型遗传毒性检测系统;该研究主要对以下两方面进行改进:第一，在遗传毒性检测元件的构建中我们利用yEGFP作为效应元件代替之前RNR3-lacZ检测系统中的lacZ，yEGFP可利用自身优势弥补lacZ作为效应元件在应用上的不足;同时利用流式细胞仪技术对GFP蛋白的表达进行定量分析，这种自动化、标准化、灵敏度高的检测手段可减少人为操作的误差，重复性好。第二，除了改进RNR3-lacZ构建以EGFP作为效应元件的检测系统RNR3_Biosensor外，我们通过文献报道发现HUG1亦具有很强地DNA损伤应激诱导表达，因此我们利用HUG1作为感应元件，yEGFP作为效应元件构建另一新型遗传毒性化合物检测系统HUG1_Biosensor，实验结果表明这两种检测系统均可检测多种遗传毒性化合物;另外在相同的实验条件下，HUG1检测系统的灵敏度要强于RNR3_Biosensor检测系统。
2.对酵母细胞进行遗传改造提高两种检测系统的检测灵敏度;
将上述两个新型遗传毒性化合物检测系统转入本实验室已构建的一种五基因缺失酵母突变体（cwp1△cwp2△snq2△pdr5△yap1△），结果表明与野生型酵母相比，突变体的应用可明显提高检测系统对不同作用类型遗传毒性化合物的检测灵敏度，尤其是对氧化性损伤试剂的检测。在野生型酵母中两种检测系统均无法对t-BHP、H2O2及MV进行有效诱导检测即对yEGFP诱导表达倍数不到2倍，而在该突变体中检测系统的灵敏度得到非常显著的提高，如t-BHP诱导时HUG1_Biosensor检测系统在该突变体中检测灵敏度比在野生型酵母中提高133倍。
为进一步提高检测系统的灵敏度，我们对上述五基因缺失酵母突变体进行了遗传改造，将酵母DNA损伤修复途径中的两个关键基因(MEG1、RAD1)进行了敲除，得到超灵敏酵母突变体。实验证明该突变体可进一步提高RNR3Biosensor和HUG1Biosensor系统检测灵敏度，尤其是对极低浓度剂量下MMS和4-NQO的有效检测。两种系统均可检测出纳克级含量的4-NQO，其中HUG1_Biosensor对4-NQO的有效检出浓度为0.3125ng/ml，同时检测灵敏度比野生型酵母中提高300多倍。此外，超灵敏突变体检测系统还可检测出几种化疗药物的遗传毒性效应。含有RNR3_Biosensor和HUG1_Biosensor的超灵敏突变体检测系统的检测特异性强、灵敏度高、范围广，具有发展成为环境实时在线检测体系的可能。
3.从酿酒酵母基因组中筛选影响检测系统对遗传毒性化合物检测灵敏度的易感基因群;
利用高通量酵母杂交手段分别将HUG1-yEGFP和RNR3-yEGFP转入酵母单基因缺失株文库中，获得两个高通量酵母单基因缺失遗传毒性检测文库。根据不同单基因缺失对MMS暴露后诱导yEGFP表达的差异，利用流式细胞技术分将两个文库中高、中、低三种不同荧光强度下的细胞进行分选并通过深度测序对所分选细胞条形码序列进行测序及基因鉴定，从而获得针对酵母中的遗传毒性易感基因群。实验结果发现MMS暴露后，在含有HUG1-yEGFP的酵母单基因缺失遗传毒性检测文库中一共测得2676种不同单基因缺失的酵母菌株，2745种存在于在含有RNR3-yEGFP的文库。其中高相对丰度和高荧光细胞百分比区域中，HUG1-yEGFP检测系统文库中有100种单基因缺失菌株、而在RNR3-yEGFP的文库有252种基因缺失菌株。对这些单基因缺失菌株所缺失的基因进行功能分析显示它们参与到非常多的生物过程和具有广泛的分子功能，表明这些基因极有可能是MMS处理下的遗传毒性易感基因群，这一结果为后续开展易感基因与癌症发生相互作用的研究提供了基础。