银杏内酯B对大鼠体外BMSCs向神经样细胞的诱导分化作用研究

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:loongzhou
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目的:通过检测银杏内酯B诱导后神经样细胞的功能及分化程度,研究银杏内酯B对SD大鼠BMSCs向神经样细胞的诱导分化作用,从而为药物诱导后干细胞的体内移植提供实验支持。  方法:将四周龄SD大鼠(雌雄不限),无菌条件下分离股骨和胫骨,利用密度梯度离心法和贴壁培养法分离纯化BMSCs。  取第三代BMSCs,流式细胞仪俭测后,选取分布均一的细胞,随即分为3组,PBS组、FGF组、GB组,又依据不同浓度GB组分为四个亚组GB1(20 mg/L);GB2(40 mg/L);GB3(60 mg/L);GB4(80 mg/L),分别对BMSCs进行诱导分化:倒置显微镜下于24h、48h、72h后观察各组细胞形态,应用膜片钳技术.采用全细胞记录方式,检测GB处理组和PBS组细胞的电生理;采用免疫荧光方法分别检测乙酰胆碱合成酶、胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞的表达情况。  结果:BMSCs鉴定:1、形态学观察:对获取细胞经过梯度密度离心法结合连续换液培养传至第三代,细胞逐渐纯化,形态均一,贴壁好,形态学观察到细胞扁平呈梭型,集落细胞排列有一定方向性,呈辐射状、旋涡状排列。2、流式细胞学鉴定:对第三代细胞进行流式细胞计数显示CD90、CD29、阳性细胞数在90%左右,CD34、CD45阳性细胞小1%。3、分化能力:经GB、FGF诱导的BMSCs细胞在形态学和免疫荧光、神经电生理检测证实其有向神经样细胞的转化能力。  诱导后细胞的鉴定:1、形态学观察:倒置显微镜下观察经GB诱导24h后少量细胞形态发生改变,细胞形态不规则,细胞突起逐渐增多,突起相互连接形成网状,胞体收缩变圆,并出现突起,立体感、折旋光性增强,并可见细胞间形成的网络结构,48h诱导的细胞形态更加明显,细胞突起变长,折光性强,72小时诱导后的细胞可见胞核椭圆形或圆形,胞核周边可见明显光晕。诱导24h、48h、72h后的每百个细胞中神经样细胞数量统计显示,不同剂量银杏内酯B组较PBS组明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),与PBS组比较,诱导组间差异无统计学意义(P>0.05),银杏内酯B组各剂量组间比较无明显统计学差异(P>0.05)。2、经GB诱导后的的神经样细胞与未诱导的BMSCs的膜电位特性有显著的改变,得到的神经样细胞具有类似于神经元的电生理的改变。GB诱导后细胞与对照组诱导细胞的电流幅值存在较大差异。全细胞电压钳记录模式下,可记录到一系列内向电流,激活阈值在-30mV,峰值电压在0mV,未分化细胞的峰值电流为(1.47±0.15PA/PF,n=10),GB诱导后的神经样细胞为(2.18±0.16 PA/PF,n=24),差异有统计学意义(P<0.05)。3、免疫荧光染色显示经过GB及FGF诱导的细胞,神经特异性标志物GFAP、NSE、CHAT阳性表达的细胞数量较PBS组增加。免疫荧光染色阳性细胞数计数显示,各组细胞免疫荧光结果在GB组中GFAP、CHAT、NSE阳性细胞数较PBS组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);GB各剂量组中阳性细胞数较FGF组差异无明显统计学意义(P>0.05)。GB组间比较无明显差异性(P>0.05)。  结论:1.经GB诱导的BMSCs,不仅具有神经样细胞的外形和免疫学特征,而且具有神经元相类似的基本电生理功能和神经递质的合成功能。  2.GB诱导的BMSCs可以同时表达向多种神经样细胞分化方向神经标志物,且其阳性率均较高,表明短期诱导的BMSCs细胞具有了定向向神经样细胞分化的干细胞特征。  3.银杏内酯B可诱导BMSCs向神经样细胞分化。
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