猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)是一种典型的嗜神经性冠状病毒,其主要感染3周龄以内的哺乳仔猪,可引起脑脊髓炎,呈现明显抽搐、呕吐等临床症状,死亡率可达100%。该病毒主要侵害神经系统,但其所致神经损伤的机制尚未完全阐明。微丝(纤维形肌动蛋白,F-actin)作为真核细胞细胞骨架的重要组成部分,是病原体进入宿主细胞的第一个物理屏障。神经细胞的形态结构和功能主要取决于F-actin的动态调节。本课题组前期研究发现,PHEV通过网格蛋白介导的内吞作用进入神经细胞依赖于F-actin的完整性。F-actin是否参与PHEV入侵过程,以及F-actin结构改变对PHEV复制的影响及其在侵袭过程中的动态调控机制目前尚不清楚。因此,从F-actin角度探讨PHEV诱导神经元损伤的机制不仅有助于阐明PHEV的发病机制,而且为寻找新的抗病毒靶点提供了理论依据。本实验在PHEV感染小鼠神经瘤母(Neuro-2a,N2a)细胞模型的基础上,利用免疫荧光染色和流式细胞术检测病毒感染早期不同时间点细胞F-actin结构变化情况。与接种灭活病毒细胞和对照组细胞相比,在PHEV感染期间,F-actin结构呈现出应力纤维溶解、丝状伪足和片状伪足逐渐形成,随后应力纤维再次形成的动态变化;流式细胞术检测结果显示,F-actin在病毒感染后5 min(mpi)快速聚合,然后在20 mpi开始解聚。这些结果表明PHEV感染N2a细胞早期可引起F-actin骨架重塑。随后,利用间接免疫荧光和qRT-PCR方法检测PHEV进入动力学。结果显示,病毒颗粒沿着丝状伪足移动进入细胞,且病毒进入主要发生在15 mpi,推测F-actin结构重塑可能与病毒进入相关。进而利用Cyto D预处理细胞破坏F-actin结构动态变化,qRT-PCR、Western blotting、间接免疫荧光及病毒生长动力学检测其对病毒进入和增殖的影响。结果表明,Cyto D以剂量依赖性方式抑制病毒进入且降低病毒滴度,证实PHEV进入细胞与其引起的F-actin骨架结构动态变化密切相关。Cofilin为细胞骨架解聚因子家族中重要的调控蛋白,可通过切割F-actin调控其动态变化。为进一步明确F-actin发挥作用的途径,本实验对cofilin在PHEV进入N2a细胞过程中的作用进行研究。利用Western blotting和间接免疫荧光技术检测病毒进入过程中cofilin激活情况。结果显示,cofilin活性出现动态变化,与F-actin变化趋势一致,推测其可能参与PHEV侵入细胞的过程。进而将cofilin siRNA、cofilin-WT(野生型)、cofilin-S3A(激活型)、cofilin-S3D(失活型)过表达载体分别转染N2a细胞后再接种PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光法检测病毒进入量及F-actin变化情况。结果显示,cofilin siRNA和三种过表达载体均抑制病毒进入,表明PHEV有效进入细胞需要借助cofilin动态磷酸化而非其某一固定状态;此外,siRNA可破坏细胞应力纤维并使细胞表面形成小突起,且PHEV可减少因增强cofilin活性引起的棒状结构产生,证实cofilin活性影响PHEV诱导F-actin骨架变化和病毒进入过程。同时,检测cofilin上游激酶LIMK在PHEV感染过程中的激活情况及其对病毒进入的影响。结果显示,LIMK活性同样出现动态变化,且趋势与cofilin活性变化趋势一致;降低细胞内源性LIMK表达可抑制病毒进入,表明LIMK作为cofilin上游激酶调控PHEV侵入细胞的过程。受体酪氨酸激酶(RTKs)、整合素(integrins)、G蛋白偶联受体等信号分子均可参与F-actin细胞骨架调控过程。为进一步研究F-actin介导PHEV入侵N2a细胞的分子机制,选用针对上述多种信号分子的特异性化学抑制剂,分别阻断由其介导的信号通路,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down和间接免疫荧光法分析不同信号分子对cofilin活性及PHEV入侵的影响。结果显示,RTKs信号分子不参与病毒入侵过程;integrinα5β1不仅在PHEV附着时累积,而且还促进下游激酶FAK和PI3K/Akt信号通路的活化;Src激酶不参与病毒诱导的F-actin骨架重排过程,也不影响cofilin活性,说明PHEV使用独立于Src家族的FAK信号传导途径调节F-actin骨架重排;Rac 1和Cdc 42 GTPases为integrinα5β1-FAK途径的下游Rho GTPases,并且Rac 1和Cdc 42 GTPases都通过调节下游PAK 1分子来影响F-actin骨架重排和cofilin活性;Rho A作为integrinα5β1-PI3K/Akt途径的下游靶蛋白,并且通过调控下游ROCK激酶来影响F-actin骨架重排和cofilin活性。上述结果证实,PHEV通过integrinα5β1信号分子的FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK及PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK两条信号通路协同作用来促进cofilin磷酸化进而诱导肌动蛋白聚合,促进PHEV高效进入N2a细胞;随后病毒穿透细胞膜又激活cofilin,调节应力纤维的形成以促进病毒运输。Integrinα5β1信号分子为PHEV进入N2a细胞的关键分子,为研究其在体内对病毒感染的作用,本实验在PHEV感染小鼠模型的基础上,检测integrinα5β1信号分子及下游通路激活情况。结果显示,integrinα5β1表达量在病毒感染小鼠过程中增加,与细胞水平结果相一致;FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK通路被激活,而PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK通路未被完全激活,提示integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin可能在体内病毒感染过程中也发挥作用。小鼠静脉注射ATN-161以降低脑组织integrinα5β1表达量,随后滴鼻接种PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down、间接免疫荧光、H&E染色等方法检测ATN-161在体内是否具有抗病毒作用。结果显示,小鼠静脉注射ATN-161后,其发病时间延缓、临床症状减轻、体重下降率降低且其生存期显著延长;H&E染色发现,ATN-161治疗后,小鼠大脑皮质神经元细胞趋于正常,并且在5 dpi时未出现典型的非化脓性脑炎病理变化;ATN-161可使小鼠脑内病毒表达量显著降低且FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin通路激活情况被抑制。上述实验证实,integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMKcofilin可促进PHEV在体内增殖;而且integrinα5β1抑制剂ATN-161在体内具有一定的抗病毒作用。综上所述,本研究首先阐明了PHEV进入N2a细胞期间F-actin骨架重塑的特定机制,并确定cofilin活性为F-actin骨架重塑和病毒进入过程之间的分子开关,为深入解析PHEV诱导神经细胞损伤的机制奠定基础。另外,integrinα5β1特异性抑制剂ATN-161在体内具有一定抗病毒作用,说明cofilin和上游信号分子可作为治疗性抗病毒策略的可行性靶标,为新型抗病毒药物的研发提供理论支撑。