目的近年来，各种原因导致视网膜视神经损伤而致视网膜细胞凋亡引起了人们越来越多的研究兴趣。在临床上发现，各种累及视网膜、视神经功能的疾病后期均有神经细胞的死亡，而神经细胞的死亡中凋亡占很大的比重。因此，从不同水平抑制或调控凋亡及凋亡相关基因，对于此类疾病的治疗将起到至关重要的作用。目前，视网膜缺血．再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）损伤模型是公认的研究视网膜损伤和视网膜细胞凋亡的重要工具之一。在视网膜缺血—再灌注损伤中，再灌注开始后，神经视网膜各层相续出现空泡，水肿。到晚期神经视网膜层细胞减少，出现细胞的凋亡。研究发现，大鼠视网膜短暂缺血后，视网膜内层神经节细胞层、内核层可见凋亡细胞。在视网膜缺血—再灌注损伤中，有多种凋亡相关基因表达异常。因此凋亡细胞的比率及凋亡相关基因表达的变化可作为评价神经保护剂的可靠指标之一。细胞凋亡过程中，存在促凋亡和抗凋亡基因的拮抗表达。其中caspase-3是一个重要的促凋亡基因，抑制caspase-3的活性即可明确阻止凋亡的发生。Bcl-2是一个经典的抗凋亡基因。Bcl-2和caspase-3的表达情况在凋亡的研究中的重要性是不言而喻的。P38 MAPK是丝裂素激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的一员。P38 MAPK属于应激激活的蛋白激酶，在病理条件下被激活，参与细胞的损伤凋亡过程。信号转导因子与转录激活因子（signaltransducer and activator of transcription，STAT）是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子。STAT3是JAK-STAT信号转导通路的重要成份，一般认为STAT3的过度表达可抑制凋亡的发生。近十几年，对视网膜损伤的神经保护渐渐引起了人们重视。视网膜损伤、变性疾病中如何保护神经细胞，从而保护视功能越来越引起临床及基础研究者的重视。目前，已发现多种内源性、外源性因素对视网膜神经损伤有保护作用，其中钙通道阻滞剂引起研究者广泛关注。多种组织器官的缺血-再灌注损伤中均发现有细胞钙内流、细胞内钙超载，从而致细胞凋亡。抑制钙内流从而抑制凋亡的发生是目前研究者的共同思路。已发现L型电压门控性钙通道阻滞剂尼莫地平可选择性地阻断神经组织中的钙通道。目前尚无尼莫地平对视网膜I-R损伤后凋亡相关基因及信号转导通路影响的报道。本研究即着手对L型钙通道阻滞剂对视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用及其可能的信号转导通路进行探讨，以期能指导于临床，找出最适用于临床的视网膜神经保护剂。材料与方法第一部分大鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型的制备及标本采集Wistar大白鼠142只，体重250-270g，雌雄兼用。随机分为4组，A组正常（空白）对照组：7只。B组视网膜缺血-再灌注组（实验对照组）：45只，C组尼莫地平组：45只。D组低压灌注组（假手术组）45只。B组动物模型制作方法：升高眼内压至110mmHg，直视下见视网膜缺血发生，1小时后降低眼内压至＜20mmHg，视网膜血管重新开放，即再灌注发生。C组：于尾静脉注入尼莫地平（1mg／kg体重）半小时后同B组方法制备视网膜缺血-再灌注模型，并于再灌注开始同时再注射相同剂量尼莫地平一次。D组：低压灌注组（假手术组）：模型制备基本同B组，所不同为眼内压为20mmHg。B、C、D组分别于再灌注发生后0小时、2小时、6小时、12小时、24小时、72小时和168小时各处死5只大鼠（10眼）。其中4眼固定于含1‰DEPC的4％多聚甲醛液中，水平面剖开，常规包埋于石蜡中；制成4μm切片，分别行HE染色、免疫组化和原位杂交检测。另6只眼摘除后剥离视网膜，立即冻于液氮中行RT-PCR检测。另外分别于再灌注发生后0小时、6小时、12小时、24小时、72小时分别处死2只大鼠（4眼），剥离视网膜冻存，行流式细胞仪检测。A组共14眼，4眼制成石蜡标本，10眼冻存行RT-PCR检测和流式细胞仪分析。第二部分尼莫地平对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后视网膜组织病理学改变的影响光镜下观察视网膜变化，以Metamorph图像分析软件测量视网膜内界膜至外界膜距离（厚度）。测量地点为视乳头鼻侧200μm外，每张切片测3次，取其平均数。每个标本测2张切片。将所测值（像素数）换算为微米数。所测视网膜数据以SPSS统计软件进行方差分析和SNK检验。第三部分尼莫地平对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后细胞凋亡的影响机械法得到细胞悬液，碘化丙啶一步法染色。上FACSCAN流式细胞仪，以Cellquest多功能软件分析各样本细胞周期分布及凋亡情况，获得凋亡细胞百分率，以SPSS软件进行统计学分析。第四部分尼莫地平对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后凋亡相关基因表达的影响每个标本切片3张，以免疫组化法检测不同时点caspase-3和Bcl-2表达情况。用Metamorph软件计算出阳性细胞平均吸光度值，以SPSS进行统计学分析。第五部分尼莫地平对大鼠损伤缺血-再灌注细胞信号转导系统的影响以RT-PCR及原位杂交方法检测不同时点P38 MAPK和STAT3 mRNA表达。RT-PCR图像以Kodak 1D成像分析系统进行分析，测定目的基因mRNA相对含量，以此作统计学检验。结果一、视网膜缺血-再灌注后组织病理学改变A组正常大鼠视网膜：视网膜分为十层（与人视网膜相似）。B组于缺血-再灌注2小时后，即出现节细胞层和内核层细胞空泡化，间质疏松，神经纤维层及内丛状层疏松，内核层细胞排列紊乱。6小时后上述变化更为明显，至12小时视网膜水肿达到最严重。24小时与12小时基本相同，开始出现核浓缩（节细胞层），72小时，视网膜水肿减轻，节细胞层及内核层核浓缩多量。168小时，视网膜元水肿，节细胞层及内核层细胞明显减少，内丛状层变薄，视网膜呈萎缩状。C组：组织学变化趋势与B组相似，水肿，丛状层疏松程度较轻，核浓缩细胞减少，至168小时细胞数减少及视网膜厚度变薄程度均较B组轻。D组低压灌注组：视网膜组织学所见与正常视网膜相同。二、视网膜厚度的测量在石蜡切片上，视网膜内界膜至外界膜距离（厚度），正常大鼠视网膜平均为127.31μm。视网膜缺血-再灌注损伤后，自2小时起视网膜逐渐加厚，至12小时达高峰，平均为181.04μm，72小时后厚度减小，至168小时，视网膜明显变薄，平均82.88μm。C组尼莫地平组，视网膜亦于2小时逐渐加厚，程度较B组略轻。较为明显的差别出现于缺血-再灌注168小时后，视网膜平均厚度为105.40μm。低压灌注组未见视网膜厚度变化。以所测数据分别各时点的各组间厚度行方差分析，可见0小时及2小时各组无统计学显著性，其它各时点A组、D组与B组、C组及B组与C组间均具有统计学显著性。三、流式细胞仪检测结果A组和D组可见明显二倍体峰，亚G₀／G₁期比率＜4％。B组缺血-再灌注组，6小时后亚G₀／G₁峰（凋亡峰）增加，12小时后逐渐增多，至24小时达到顶峰，72小时后下降。C组：趋势与B组相同，所不同为凋亡峰均较小。以Cellquest软件进行分析后的凋亡细胞比率进行统计学检验（X²检验），发现B组、C组、D组各时点（0小时除外）比较均具有统计学显著性（P＜0.01）。四、凋亡相关基因表达①caspase-3：视网膜caspase-3免疫组化阳性表达为细胞核呈棕黄色。A组正常视网膜和D组低压灌注组caspase-3表达仅限于节细胞层、0-1个／高倍视野。B组2小时后可见节细胞层散在阳性，6小时后节细胞层内核层阳性核增加，至24小时达到顶峰，72小时仍可见多量细胞核着染，至168小时仍有细胞核呈棕黄色。C组：caspase-3表达趋势同B组。阳性细胞数及着染深度均小于B组。以Metamorph图像分析软件进行图像分析后的平均光密度值行统计学分析表明：除0小时、168小时这两个时点外，其它各时点A、D组与B组、A、D组与C组、B组与C组间均同时具有统计学显著性（P＜0.05）。A组与D组间无统计学显著性。②Bcl-2：视网膜Bcl-2阳性表达为棕色颗粒着染，位于神经纤维层，内丛状层，外丛状层，视锥视杆层，以及内、外核层的细胞核之间（即位于细胞浆和细胞突起）。A组、D组几乎无表达。B组：再灌注2小时后即可见神经纤维层，节细胞层，内丛状层染色阳性，随着时间推移，染色渐加深，并逐渐向视网膜外层扩展，最终达外丛状层，至24小时达到高峰，72小时后逐渐下降。C组：时间变化趋势同B组，但较B组染色深。再灌注2小时，即可见明显的神经纤维层和内丛状层着色，至12小时，可见大量的Bcl-2沉淀于外界膜下和视锥视杆层。至一周时仍未达到基线水平。经metamorph软件进行图像分析后进行统计分析检验，可见B组与C组，B组与A组，C组与A、D组间存在统计学显著性。五、P38 MAPK和STAT3 mRNA表达的变化（1）P38 MAPK RT-PCR结果：A组及D组视网膜仅有少量表达。B组再灌注2小时后，P38MAPK表达开始增加，至12小时达到顶峰，并持续至24小时，72小时后逐渐下降，至168小时仍有少量表达。C组趋势与B组相似，但其出现时间及峰值均小于B、组，表明其表达被抑制。（2）STAT-3 RT-PCR结果：时程与P38 MAPK相似，所不同为C组表达较B组为强。对二组BT-PCR结果行统计学分析表明：A组、D组与B组、C组间及B组与C组间具有统计学显著性。（P＜0.05）（3）P38MAPK mRNA原位杂交：正常视网膜节细胞层可见数个细胞浆着色。但B组再灌注2小时后阳性细胞开始增多，且染色均转移至细胞核内。于6～12小时达到高峰，至168小时仍可见较多阳性核。C组趋势与B组相似，但表达较B组弱。经Metamorph软件分析后和SPSS统计后，各组差异显著性与BT-PCR结果相似。（4）STAT-3 mRNA原位杂交与P38MAPK表达形式相似。所不同为C组表达较B组高。结论1．视网膜缺血-再灌注损伤可导致视网膜水肿、细胞丢失，这种损伤可于24小时左右即达到高峰，并一直持续至一周以上，从而造成晚期视网膜明显萎缩。L型钙通道阻滞剂尼莫地平可明显保护视网膜的缺血-再灌注损伤，使缺血-再灌注后视网膜细胞免于死亡，视网膜萎缩减轻。2．视网膜缺血-再灌注损伤后的视网膜神经细胞有凋亡发生，凋亡细胞于24小时达到最多。L型钙通道阻滞剂尼莫地平可使凋亡细胞减少。3．视网膜缺血-再灌注损伤后视网膜组织有促凋亡基因caspase-3和抗凋亡基因Bcl-2的拮抗表达。尼莫地平可使caspase-3表达下调，并上调Bcl-2的表达，提示尼莫地平对视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用是通过影响凋亡相关基因的表达来实现的。4．P38 MAPK参与了视网膜缺血-再灌注损伤中视网膜神经细胞凋亡信号的转导，尼莫地平通过对P38 MAPK的抑制而实现对视网膜的保护作用。5．与Bcl-2相似，STAT3是视网膜抗凋亡信号转导通路中一个重要的因子。尼莫地平通过上调STAT3的表达实现对视网膜的保护作用。