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自噬是一种调控细胞能量代谢平衡的过程。当自噬发生时,胞浆中的吞噬泡扩张后将需要降解的蛋白质和细胞器包裹形成自噬小体。自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,溶酶体中的蛋白水解酶和过氧化物酶降解自噬小体内的包容质。自噬的一个标志性变化是胞浆中LC3-I与PE(磷脂酰乙醇胺)结合形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的表达量与自噬水平呈正相关。mTOR和AMPK是感受胞浆内营养和能量水平的重用激酶。前者磷酸化ULK1的S757位点抑制其活性以及自噬,后者磷酸化ULK1的S555位点,诱导自噬。鼠伤寒沙门菌是一种革兰氏阴性兼性胞内寄生菌。该菌进入宿主细胞后,形成含沙门菌的囊泡(SCV),细菌的Ⅲ型分泌系统释放效应蛋白导致囊泡破损。沙门菌突破囊泡进入胞浆后激活选择性自噬。然而,沙门菌可通过激活mTOR和降解AMPK逃避自噬发生。由于大部分抗生素难以进入胞浆杀死胞内菌,通过自噬激活剂调控自噬杀死胞内菌是目前研究的一个热点。来氟米特是治疗类风湿性关节炎的抗炎药。其活性代谢产物A771726能抑制嘧啶核苷酸合成,抑制蛋白酪氨酸激酶和S6K1激酶活性。本实验室近期研究发现,A77 1726通过抑制mTOR下游的S6K1激活AMPK,磷酸化ULK1并诱导自噬。本研究旨在探讨A77 1726是否可通过激活自噬,抑制鼠伤寒肠炎沙门菌胞内增殖。小鼠RAW264.7巨噬细胞系和人HeLa宫颈癌上皮细胞系经A77 1726处理后,Western blot分析自噬相关蛋白和自噬通路中的蛋白激酶磷酸化水平。结果显示,A77 1726呈时间和剂量依赖性增加LC3-Ⅱ的表达量,反馈激活PI-3激酶信号通路,上调AMPKT172、ULK1S757和ULK1S555的磷酸化水平。荧光共聚焦显微镜显示,A77 1726显著增加RAW264.7和HeLa细胞中的自噬小体和自噬溶酶体数量。我们进一步研究了 A77 1726是否能增强鼠伤寒沙门菌感染细胞的自噬。结果显示,A77 1726处理沙门菌感染的RAW264.7细胞,LC3-Ⅱ表达量以及AMPKT172和ULK1S555的磷酸化水平显著高于经沙门菌或A77 1726单独处理的细胞。荧光共聚焦显微镜发现,经沙门菌感染和A77 1726共处理的细胞中,自噬小体和自噬溶酶体显著高于经沙门菌或A771726单独处理的细胞。这些结果表明,A77 1726可以促进沙门菌诱导的细胞自噬。最后,我们研究了 A77 1726诱导的自噬是否影响鼠伤寒沙门菌的胞内增殖。菌落形成试验发现,A77 1726处理RAW264.7细胞后显著减少了细胞内的沙门菌数。荧光共聚焦显微镜发现,A77 1726显著减少RAW264.7细胞中带红色荧光标记的沙门菌的数量。A771726不影响LB培养基中生长的沙门菌生长增殖。综上所述,我们的研究发现A77 1726通过抑制S61K1激酶活性,激活AMPK和ULK1并诱导RAW264.7和HeLa细胞自噬。A77 1726通过促进沙门菌感染的RAW264.7细胞中的AMPK和ULK1的磷酸化水平进一步提高细胞自噬水平。A77 1726能有效抑制沙门菌在巨噬细胞中的胞内增殖。这些结果表明,A77 1726作为自噬激活剂能抑制胞内菌增殖,进一步体内验证其药效后有望开发为一种新型的抗菌药物。