目的:基于前期已证实黄芪-葛根药对具有保护乙醇性胃粘膜损伤作用的研究结果,考察黄芪-葛根药对有效成分黄芪甲苷、葛根素及其配伍对乙醇及吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤的保护及抗氧化作用;分析黄芪甲苷-葛根素成分配伍在胃粘膜保护的协同增效作用;初步探讨黄芪甲苷-葛根素保护胃粘膜的抗氧化分子作用机制。方法:1.高效液相色谱法测定黄芪-葛根药对中黄芪甲苷、葛根素的含量。黄芪-葛根药对(3:1)按加10倍量水、煎煮30min、重复3次,水煎浓缩制备。采用高效液相色谱法HPLC-ELSD测定药对水煎液中黄芪甲苷含量,采用HPLC-UV测定葛根素的含量。2.观察黄芪甲苷-葛根素配伍、黄芪-葛根药对对乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响。SD大鼠,分为14组:1)正常组、2)模型组、3)阳性药组、4)AS-Ⅳ高组(黄芪甲苷高剂量组)、5)AS-Ⅳ中组(黄芪甲苷中剂量组)、6)AS-Ⅳ低组(黄芪甲苷低剂量组)、7)Pur高组(葛根素高剂量组)、8)Pur中组(葛根素中剂量组)、9)Pur低组(葛根素低剂量组)、10)AS中+P中组(黄芪甲苷中剂量配伍葛根素中剂量组)、11)AS中+P低组(黄芪甲苷中剂量配伍葛根素低剂量组)、12)AS低+P中组(黄芪甲苷低剂量配伍葛根素中剂量组)、13)AS低+P低组(黄芪甲苷低剂量配伍葛根素低剂量组)、14)黄芪-葛根药对组。除药对组采用灌胃外,各组均以腹腔注射给药,连续4d。末次给药75min后,用无水乙醇5ml/Kg灌胃造模,75min后,取胃,观察胃粘膜损伤分数,病理学改变,检测胃组织超氧化物岐化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的含量。3.观察黄芪-葛根药对对吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响。SD大鼠,分为6组:1)正常组、2)模型组、3)阳性药组、4)黄芪-葛根药对高剂量组、5)黄芪-葛根药对中剂量组、6)黄芪-葛根药对低剂量组,各组连续灌胃给药4d,末次给药后75min,除正常组外,采用吲哚美辛腹腔注射造模,6h后,取胃,观察胃粘膜损伤分数、病理学改变,检测胃组织MDA、SOD、ROS的水平。4.观察黄芪甲苷-葛根素配伍对吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响。SD大鼠,不设药对组,其余分组给药同实验2.共13组。末次给药后75min,以吲哚美辛腹腔注射造模,6h后,取胃,观察胃粘膜损伤分数、病理学改变,检测胃组织MDA、SOD、ROS的水平。5.考察黄芪甲苷、葛根素及其配伍、黄芪-葛根药对对胃粘膜组织Kear1-Nrf2-ARE信号通路关键蛋白与基因表达的影响。采用Western-blot、Real time PCR法检测实验2.及实验4.大鼠胃粘膜组织核转录因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)、NDPH苯醌脱氢酶(NQO1)、谷胱苷肽过氧化物酶2(GPx2)、谷胱苷肽S转移酶(GST)蛋白及基因的表达。结果:1.黄芪-葛根药对水煎液中含有黄芪甲苷、葛根素,含量分别为1.02 mg/ml、0.058 mg/ml,RSD%均小于 3%。2.黄芪甲苷-葛根素配伍、黄芪-葛根药对对乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响。1)形态学:乙醇诱导的胃粘膜损伤模型大鼠胃粘膜外观损伤严重,多见条索状、点、线状出血;病理学显示模型大鼠胃粘膜组织受到破坏,上皮细胞固有层分离、胃腺体排列不规整、胃粘膜下层水肿,核固缩甚至溶解,毛细血管扩张、红细胞外渗;给药各组胃粘膜损伤坏死程度明显轻于模型组,以AS-Ⅳ高、中组、Pur高组、AS中+P中配伍组改善效果最为明显。2)胃粘膜损伤分数:给药各组均能不同程度地降低乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤分数,AS-Ⅳ、Pur各自三个剂量组间存在着一定的量效关系;AS中+P中配伍组胃粘膜损伤分数低于各自单独给药。3)SOD、MDA、ROS:乙醇诱导的胃粘膜损伤模型大鼠胃组织SOD活力下降、MDA、ROS含量上升,给药各组能不同程度地降低ROS水平,提高SOD活力;与AS-Ⅳ低组、Pur低组比,AS低+P低组SOD活力进一步提高,MDA含量进一步降低;与AS-Ⅳ低组比,AS低+P低组ROS水平进一步降低。3.黄芪-葛根药对对吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤模型大鼠胃粘膜外观以线状、点状出血为主,光镜下可见胃上皮细胞变性、脱落,粘膜水肿、出血、炎症细胞浸润及水肿等病理改变,同时胃组织ROS、MDA含量上升,SOD活力下降;黄芪-葛根药对高、中剂量组均能不同程度地改善模型大鼠胃粘膜外观、病理学变化,降低胃粘膜损伤分数及胃粘膜组织MDA、ROS 水平。4.黄芪甲苷-葛根素配伍对吲哚美辛诱导的大鼠胃粘膜损伤的影响1)形态学:吲哚美辛45mg/Kg腹腔注射可致大鼠胃粘膜出现明显糜烂,出血、以线状、点状出血为主。病理学显示胃小凹结构受损明显,上皮细胞变性、脱落、粘膜水肿、出血、胃腺体排列素乱、萎缩、可见炎症细胞浸润,阳性药组、黄芪甲苷各剂量组、AS中+P低组、AS低+P低组胃粘膜的形态学改善作用较为明显。2)胃粘膜损伤分数:阳性药组、AS-Ⅳ高、中组,AS中+P中组、AS中+P低组、AS低+P低组能明显降低模型大鼠胃粘膜损伤分数,AS低+P低组胃粘膜损伤分数明显低于Pur低剂量组,亦有低于AS-Ⅳ低组的趋势。3)MDA、SOD、ROS:吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤大鼠胃组织ROS、MDA含量上升,SOD活力下降;AS-Ⅳ高、中组、AS中+P中组、AS低+P中组、AS低+P低组能明显降低模型大鼠胃组织MDA的含量;AS-Ⅳ高、中组,Pur高、低组,AS低+P中组、AS低+P低组均能明显提高模型大鼠胃组织SOD活力;除AS低+P中组,给药各组均能不同程度降低模型大鼠胃组织ROS含量。5.黄芪甲苷、葛根素及其配伍、黄芪-葛根药对保护胃粘膜损伤的分子机制。1)乙醇诱导的胃粘膜损伤模型大鼠胃组织细胞核内Nrf2、胃组织HO-1、NQO1、GPx2、GST蛋白和基因表达升高;AS-Ⅳ中组、Pur中组、AS中+P中组、药对组能不同程度地上调各蛋白和基因的表达。2)吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤模型大鼠胃组织HO-1、NQO1、GPx2、GST蛋白和基因的表达上升;AS-Ⅳ中组能上调各基因的表达。结论:1.黄芪-葛根药对、黄芪甲苷-葛根素对乙醇诱导的胃粘膜损伤具有保护作用,能够抵抗胃粘膜组织的氧化应激状态,其作用可能与激活Nrf2-ARE通路,促进下游抗氧化、解毒相关蛋白和基因的表达有关。2.黄芪-葛根药对、黄芪甲苷对吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤具有保护作用,能够抵抗胃粘膜组织的氧化应激状态。3.黄芪甲苷保护吲哚美辛诱导的胃粘膜损伤可能与促进Nrf2-ARE下游相关抗氧化、解毒基因的表达有关。4.黄芪甲苷-葛根成分素配伍在保护胃粘膜、抗氧化具有一定的协同作用。