研究背景肝细胞癌是肝癌的主要组织学亚型,占原发性肝癌的90%以上,是全世界癌症相关死亡的第三大常见原因。肝癌目前的治疗手段主要有手术切除、肝移植、局部消融、介入、分子靶向治疗及其他治疗手段。然而,肝癌细胞的异质性和耐药性是肝癌治疗的主要障碍。最近的研究证据表明,纳米颗粒与药物或基因载体结合可以增强癌细胞的药物敏感性。纳米二氧化钛(TiO2)因其优异的化学稳定性、生物相容性、光催化性而被生物医学领域的研究者们热切关注。纳米TiO2通过促进活性氧自由基(ROS)的产生而影响细胞功能,诱导恶性肿瘤细胞凋亡,纳米TiO2可引起细胞或组织的氧化应激,进而杀伤癌细胞。然而,关于纳米TiO2对肝癌的治疗作用及其潜在机制的仍然缺乏深入研究。ROS诱导的内质网应激反应可通过诱导内质网激酶(PERK)、转录因子6(ATF6)、真核翻译起始因子(eIF-2α)、X-box结合蛋白1等内质网感受器蛋白及其下游信号通路的表达,触发细胞凋亡。据报道,纳米TiO2参与了内质网应激介导的癌细胞凋亡。本研究探讨了纳米TiO2对肝癌细胞的毒性作用及其机制,以揭示其在肝癌患者治疗中的潜在应用。研究目的(1)明确纳米TiO2对肝癌细胞和正常肝细胞生长的影响。(2)明确纳米TiO2对肝癌细胞和正常肝细胞凋亡的影响。(3)探讨内质网应激信号通路在纳米TiO2诱导肝癌细胞凋亡产生的机制。研究方法(1)使用浓度为50ug/ml的纳米TiO2制备液处理实验6孔板:①称取5.0 mg纳米TiO2粉末使其充分溶于100 ml 75%酒精溶液中;②分别在6孔板各孔中加入400μl酒精、100μl纳米TiO2制备液+300μl酒精、200μl纳米TiO2制备液+200μl酒精、300μl纳米TiO2制备液+100μl酒精、400μl纳米TiO2制备液;③使实验孔板中的悬液均匀平铺于底面,然后置于电热恒温干燥箱,恒定于60℃;④待酒精彻底蒸发后,取出实验孔板置于超净工作台内,用紫外线灯照射2 h,备用。(2)将固定数量的人正常肝细胞株LO2细胞和人肝癌细胞株HepG2细胞,分别加入经过不同浓度纳米TiO2处理的6孔板中,培养48 h后收集处理细胞,检测细胞的生长情况,通过细胞计数的方法,观察纳米TiO2对正常肝细胞及肝癌细胞生长的影响。(3)将固定数量的人正常肝细胞株LO2细胞和人肝癌细胞株HepG2细胞,分别加入经过不同浓度纳米TiO2处理的6孔板中,培养48h后收集处理细胞,通过流式细胞术检测细胞周期分布变化、细胞凋亡情况和细胞内ROS水平,观察纳米TiO2对LO2细胞和HepG2细胞凋亡的影响。(4)将固定数量的人正常肝细胞株LO2细胞、人肝癌细胞株HepG2和Bel-7405细胞,分别加入经过不同浓度纳米TiO2或/和内质网应激抑制剂4-PBA处理的6孔板中,培养48 h后收集处理细胞,提取细胞中的蛋白,通过Western Blot法分析细胞中ATF6、PERK和Bax蛋白的表达量,来确定纳米TiO2通过内质网应激诱导肝癌细胞凋亡的过程。(5)将固定数量的HepG2细胞,通过皮下注射的方式注入雄性BALB/c裸鼠体内,建立皮下肿瘤模型进行体内动物实验。根据注入物不同分成经PBS处理的HepG2细胞的对照组和经纳米TiO2处理的HepG2细胞的实验组。每天观察裸鼠饮食、活动情况及体重变化。每6天施用一次PBS溶液和纳米TiO2,7周后安乐死处理裸鼠,观察比较注入PBS和纳米TiO2对裸鼠皮下成瘤的影响情况。通过Western Blot法和免疫组化法比较分析经PBS处理和纳米TiO2处理对人肝癌HepG2细胞转移瘤的内质网应激相关蛋白的影响。研究结果(1)细胞计数分析:纳米TiO2抑制肝癌细胞生长,对正常肝细胞的生长无明显影响,并且呈一定的浓度依耐性,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)流式细胞术分析:纳米TiO2增加肝癌细胞凋亡和ROS水平,并在G1期阻滞细胞周期,但对正常肝细胞的凋亡、ROS水平、细胞周期分布无明显影响,差异具有显著统计学意义(P<0.05);纳米TiO2以剂量依赖的方式介导细胞凋亡。(3)Western Blot分析:纳米TiO2对正常肝细胞的PERK、ATF6、Bax表达无明显影响。纳米TiO2还以剂量依赖的方式增加肝癌细胞中PERK、ATF6和Bax的表达水平,且肝癌细胞经内质网应激抑制剂4-PBA处理后,PERK、ATF6和Bax的表达水平出现回调。(4)动物实验:在体内给药纳米TiO2可减少肿瘤体积,增加肿瘤组织中PERK、ATF6和Bax的表达水平。结论(1)纳米TiO2能抑制肝癌细胞生长,且阻滞细胞周期,使细胞周期停滞在G1期。同时纳米二氧化钛可使肝癌细胞内产生ROS,从而促进肝癌细胞的凋亡。(2)纳米TiO2能抑制人肝癌细胞株动物模型瘤体增长速度,且纳米二氧化钛处理过的动物瘤体内PERK、ATF6和Bax蛋白的含量明显增加。(3)纳米TiO2能浓度依赖性促进人肝癌细胞株的PERK、ATF6和Bax蛋白含量的增加,通过内质网应激诱导肝癌细胞凋亡。