枯草芽孢杆菌araR基因缺陷株的构建

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目前工业发酵原料主要来自玉米淀粉糖,随着工业发酵规模的日益扩大,与人争粮与粮争地的现象日益严重。利用木质纤维素作为工业发酵的碳源,已成为技术发展趋势。木糖是木质纤维素水解产物的主要成分,但是大多数工业微生物不能利用木糖,或者不能有效利用木糖,这是木质纤维素作为工业发酵原料急需解决的问题之一。枯草芽孢杆菌是重要的工业发酵菌种,其固有的木糖吸收调节机制使其不能利用木糖作为唯一碳源;其存在的糖分解代谢物阻遏机制使葡萄糖的存在抑制细胞对木糖的利用。如果使枯草芽孢杆菌能够利用木质纤维素水解产物作为碳源进行工业发酵,则必需对其进行遗传改造。   本文根据枯草芽孢杆菌木糖运输的调控机制,设计了敲除阻遏蛋白编码基因araR,使木糖运输蛋白编码基因araE组成型表达,而改善细胞木糖吸收能力的方案。采用两步重叠PCR方法,拼接了带有红霉素抗性基因的同源重组片段Au-E-Ap,并通过TA克隆构建了重组质粒;经spizizen转化枯草芽孢杆菌168,筛选得到了红霉素抗性转化子;经PCR验证表明,红霉素抗性基因成功的替换了枯草芽孢杆菌168染色体上araR基因的大部分编码序列,获得araR基因缺陷的重组菌株168C。固体平面培养基生长实验显示,168C在木糖或阿拉伯糖为唯一碳源的基本培养基上的生长状态明显好于出发菌株。初步证明araR基因的缺失,能够提高细胞对木糖的吸收能力。
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