论文部分内容阅读
目的：猪精液中携带病毒易导致疾病的扩散和流行,给养猪业造成了巨大经济损失。实时定量PCR方法已经广泛运用于疾病检测,但猪精液中RNA病毒缺乏有效的检测方法,本研究以期建立猪精液PRRSV、CSFV和JEV实时定量PCR检测方法,临床监测猪精液中RNA病毒感染情况。分析病毒感染对精液品质的影响。方法：查询Gen Bank中注册发表的PRRSV、CSFV和JEV相关基因序列,通过序列比对,找出各病毒的保守区域,用Primer Premier 5.0. Primer Express 3.0、Oligo7及DNASTAR等软件筛选设计符合普通PCR克隆和实时定量PCR要求的3对特异性引物,构建PRRSV、CSFV和JEV的标准质粒,并将质粒进行倍比稀释用以荧光定量PCR动力学扩增曲线和标准曲线的构建,进行敏感性实验、特异性实验、重复性实验验证方法体系,用建立的荧光定量PCR方法检测临床样品。同时取部分样品进行玻片涂抹及计数板计数,检测其精子浓度及畸形率结果：1)分别建立了有效检测精液中PRRSV、CSFV和JEV的实时定量PCR方法,PRRSV检测方法动力学扩增曲线在1.824×106拷贝/μL-1.824×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.996,扩增效率100.32%,其灵敏度可达1.824×101拷贝/μL,将与公猪精液混合的PRRSV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为102.0TCID5o/mL; CSFV检测方法的动力学扩增曲线在5.952×106拷贝/μL-5.952×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.998,扩增效率为104.66%,其灵敏度可达101拷贝/μL,将与公猪精液混合的CSFV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为30RID/mL; JEV检测方法在3.781×106拷贝/μL-3.781×101拷贝/μL之间有良好的线性关系,R2为0.991,扩增效率为101.66%,其灵敏度可达101拷贝/μL,将与公猪精液混合的JEV疫苗株以10倍梯度稀释后经RNA和反转录后再进行荧光定量PCR检测,其可检测到的最低稀释度为101.7TCID50/mL。特异性试验中仅PRRSV、CSFV及JEV相应的基因得以扩增,PCV2、PRV、PPV等猪常见病毒在实验中均呈阴性。2)采用构建的实时定量PCR方法对15个猪场的109份猪精液样品进行了3种病毒的检测,结果显示,86.67%(13/15)的猪场检出病毒阳性精液,其中PRRSV阳性率12.8%(14/109,病毒载量18.57拷贝/μL至294.41拷贝/μL), CSFV阳性率21.1%(23/109,病毒载量13.44拷贝/μL至123.39拷贝/μL),总的JEV阳性率20.2%(22/109,病毒载量为11.20拷贝/μL至246.27拷贝/μL)；PRRSV与CSFV混合感染率为2.7%,CSFV与JEV混合感染率为1.8%,三种病毒混合感染率为2.7%。同时猪场规模大小及其他风险因素对疾病的传播有一定的影响,表明并对阳性精液进行精子畸形率与精子密度的检测,结果显示PRRSV、CSFV为阳性的商品化精液和CSFV阳性的原精液在精子密度与精子畸形率上与阴性精液差别不显著,但其CSFV阳性原精液的精子密度明显小于阴性精液(p<0.05)。检测JEV为阳性的商品化精液与混合感染这三种病毒的精液的精子密度都明显差于阴性精液(p<0.05),但在精子畸形率方面差距不显著。结论：建立了灵敏度高的PRRSV、CSFV及JEV实时定量PCR方法临床上可用于监测公猪精液带毒情况及其对精液品质的影响,为预测和控制疫病的流行提供技术支持。