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【目的】研究结肠癌干细胞来源的gp96-肽复合物冲击树突细胞(DC)后,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,探讨其对结肠癌干细胞的杀伤效果。为进一步研究奠定基础。【内容】论文首先采用3种方法检测常规培养的结肠癌细胞HT29中是否存在肿瘤干细胞(CSC),三种方法分别是:双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞(SP)的比例,流式细胞仪分析HT29贴壁细胞中CD133+细胞的比例,应用Western blotting检测其ALDH1蛋白表达情况;确认存在CSC后利用无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌干细胞,并于显微镜下观察其成球状况及形态学特征;利用流式仪(检测HT29微球中CD133+细胞比例)、Western blotting(检测ALDH1蛋白表达情况)及克隆形成试验对HT29结肠癌干细胞的富集效果进行检测,并进行统计学分析。继而,从HT29微球中提取细胞总蛋白后,通过硫酸铵分级盐析,经Con A亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物备用;从脐血中分离单个核细胞,分别培养DC和CIK,用纯化的gp96-肽复合物冲击DC,与CIK共培养,采用LDH法检测gp96-肽复合物冲击DC-CIK细胞对结肠癌CSC的杀伤活性,其结果用统计学方法分析。【方法】1.用双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞的比例,利用流式、Western blotting分别检测HT29贴壁细胞CD133+细胞的比例及ALDH1蛋白表达情况。2.使用添加多种因子的无血清培养基富集HT29结肠癌干细胞,显微镜下观察微球规则后,胰酶消化,制备单细胞悬液进行传代。3.HT29结肠癌干细胞富集效果的检测:采用流式细胞术检测HT29微球中CD133的表达,Western blotting检测HT29微球中ALDH1的表达;克隆形成试验检测HT29微球的克隆形成能力。4.将从结肠癌细胞HT29微球中提取的总蛋白通过硫酸铵分级盐析后,经Con A亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物,并通过SDS-PAGE、蛋白免疫印迹对其进行鉴定,利用BCA法测定各步所得蛋白的浓度。5.从脐血分离单个核细胞后,分别培养DC、CIK,DC培养至第5天加入纯化的gp96-肽复合物,继续培养72h,促进DC成熟。于培养第10天将DC、CIK以1:5的比例混合培养,继续培养2-3天后采用LDH法检测对结肠癌CSC的杀伤活性。【结果】1.利用Hoechst33342荧光染料检测HT29细胞中SP细胞的含量为3.45%±0.05%,此外,流式细胞仪分析常规培养的HT29中CD133+细胞的比例为45.38%±10.65%;Western blotting结果显示,HT29贴壁细胞ALDH1蛋白表达阳性。采用3种方法检测常规培养的HT29贴壁细胞,均表明其存在肿瘤干细胞亚群。2.无血清悬浮培养7-10d,可形成规则的HT29微球,且状态最佳;血清可以促进HT29微球的分化;此外,HT29微球可在含血清培养基(SSM)和无血清培养基(SFM)中交替转化。3.HT29结肠癌干细胞富集效果的检测显示:HT29微球中CD133+细胞的比例高于常规培养的HT29细胞中CD133+的细胞比例(P<0.05),HT29微球中ALDH1蛋白表达量与常规培养的HT29细胞相比明显提高(P<0.05),HT29微球的克隆形成率较HT29细胞明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。4.经SDS-PAGE、蛋白免疫印迹鉴定从HT29微球中提取、纯化出的蛋白为gp96-肽复合物。1g湿重的HT29微球经纯化后可得到纯度95%的gp96-肽复合物40μg左右。5.负载gp96-肽复合物的DC与CIK共培养后,当效靶比为40:1时,对HT29结肠癌CSC的杀伤效果明显,杀伤率[(33.07±2.79)%]要高于DC+CIK组[(15.20±1.67)%](P<0.05)。【结论】1.悬浮培养法可用于富集HT29结肠癌干细胞,且便于操作,适于实验研究。2.通过硫酸铵盐析、Con A亲和层析、DEAE离子交换层析从HT29微球中成功纯化出gp96-肽复合物。3.负载gp96-肽复合物的DC-CIK可以有效地杀伤结肠癌干细胞,为肿瘤干细胞新策略的研究奠定了实验基础。