阿片成瘾,俗称“吸毒”。不仅严重损害成瘾者健康,而且引发一系列重大的社会、经济和公共卫生问题,严重阻碍社会的进步与发展,已成为世界性公害。因此,深入研究阿片成瘾神经生物学机制,寻找理想的防复吸靶标,研发自身不成瘾且具有防复吸作用的新药具有重大生物学意义。课题组前期经过系统的研究发现,胍丁胺本身不成瘾,能预防和治疗阿片躯体和精神依赖、缓解稽延症状、防复吸。在细胞水平和整体水平提示胍丁胺可能是通过激活I1咪唑啉受体(I1 imidazoline receptor,I1R)发挥上述抗阿片成瘾的作用,因此胍丁胺-I1R可能构成了一个新的阿片功能调节系统,为阿片成瘾的治疗提供了可能的新靶点和新机制。然而,胍丁胺本身并不是I1R的高特异性激动剂,同时还能与??-肾上腺素受体(?2-adrenergic receptor,?2-AR)结合,且对NMDA受体、电压门控钙通道具有阻断作用,抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性,并且以上五个作用靶点均与阿片成瘾有密切关系。因此I1R在阿片成瘾中的作用尚不能完全确定。所以,本课题组构建了IRAS(imidazoline receptor antisera selected protein)基因敲除小鼠,经证实I1R候选蛋白IRAS具有天然I1R生物学特征,为研究I1R调节阿片成瘾的作用机制提供了良好的实验模型和工具。本课题旨在采用IRAS(I1R)基因敲除小鼠系统研究I1R在阿片成瘾中的调节作用以及胍丁胺在小鼠中的抗阿片成瘾作用。本文的主要发现如下:(一)I1R在阿片精神依赖过程中的作用。(1)自身给药模型是动物操作性条件反射模型,最大程度地模拟了人类从用药到成瘾的主观能动性,反映了成瘾的形成、维持、戒断及复吸的动态过程,成为最具有测试效度的模型,为研究成瘾的机制提供了重要的实验手段。有利于动态的分析I1R在阿片成瘾发生、发展过程中的作用。在固定比率1(fixed ratio 1,FR1)训练程序下,在单剂量海洛因(0.025 mg/kg/次注射,i.v.)诱导的小鼠自身给药实验中发现,I1R敲除小鼠自身用药行为显著高于野生型小鼠。在海洛因诱导自身给药的量效曲线研究中,I1R敲除小鼠的海洛因量效曲线较野生型小鼠向上移动,提示I1R敲除后对海洛因的药物效应的反应性是增强的(敏感性增加)。从上述海洛因量效曲线中可以观察到,I1R敲除小鼠自身用药行为(有效鼻触次数)和药物摄入量显著高于野生型小鼠。以上实验结果证明I1R敲除能显著上调海洛因的正性强化作用。首次发现I1R对海洛因成瘾可能具有负性调节作用。(2)在基础行为观察实验中I1R敲除后不影响小鼠的自发活动;单次急性给予吗啡(5、10 mg/kg,s.c.)后,I1R敲除小鼠运动距离低于野生型;在吗啡(5、10 mg/kg,s.c.)诱导的行为敏化实验中,野生型小鼠可以显著形成10mg/kg吗啡诱导的行为敏化行为,而敲除型小鼠不能。这与海洛因诱发自身给药实验结果并不一致,具体原因有待进一步研究。综上结果表明,海洛因诱导小鼠自身给药模型中I1R敲除后增强了阿片成瘾的敏感性,这与前期胍丁胺激活I1R后具有抗阿片成瘾作用的结果相一致。(二)在获得I1R完全敲除模式动物后,为了提高实验结果的特异性,减少系统外因素对实验结果的影响,我们又构建了神经元特异性I1R敲除小鼠模式动物。对首批获得的神经元特异性敲除小鼠我们首先进行了基础生理及与精神行为学相关的测试。(1)在蔗糖诱导自然奖赏实验中,敲除小鼠与野生型小鼠对5%蔗糖诱导的自身用药行为无显著性差异,提示干扰神经元表达的I1R不影响自然奖赏行为。(2)在基础痛阈的测定模型中,热板实验结果表明,I1R神经元特异性敲除小鼠的基础痛阈减弱,提示神经元中I1R可能参与疼痛的调节。而该发现与前期研究中胍丁胺激活I1R发挥弱的镇痛作用的结果相一致。(3)在阿片类物质吗啡诱导的高活动性实验中,单次给予吗啡(4、8、16mg/kg,s.c.),均能显著增高野生型和I1R神经元特异性敲除小鼠的活动度,且两者无显著性差异。以上结果提示,I1R神经元特异性敲除不影响生理性自然奖赏效应,同时神经元的I1R可能对疼痛的形成有一定的抑制作用,而胍丁胺激活I1R发挥弱的镇痛作用,增强吗啡镇痛从而降低吗啡躯体依赖的形成,所以神经元的I1R也可能参与阿片类物质成瘾的调节。而神经元特异性敲除后对于中高剂量吗啡的反应性无显著性变化。(三)基于本研究的I1R敲除动物为小鼠,而前期研究中胍丁胺具有抗阿片精神依赖的作用均是在大鼠上获得的,因此我们预先采用与敲除动物遗传背景相近的C57BL/6J小鼠进行研究,观察胍丁胺对吗啡诱导的行为敏化所致的精神依赖的药理学作用。(1)胍丁胺(1-80 mg/kg,s.c.)不影响小鼠自发活动和急性吗啡(10 mg/kg,s.c.)诱导的小鼠高活动性;对吗啡诱导行为敏化有减弱的趋势,并无显著性差异。(2)胍丁胺具有多个作用靶点,如I1R、?2-AR、NMDA受体等。其中对?2-AR的亲和力仅次于I1R,另有研究表明I1R和?2-AR存在功能上的交互作用。因此我们联合给予?2-AR选择性拮抗剂育亨宾观察胍丁胺对阿片成瘾的调节作用。实验结果如下:育亨宾(2 mg/kg,i.p.)单独给药不影响实验动物自发活动和急性吗啡致高活动性。当育亨宾(2 mg/kg,i.p.)与胍丁胺(80 mg/kg,s.c.)共同给药时显著降低小鼠急性吗啡致高活动性和行为敏化的形成。提示育亨宾阻断?2-AR的同时胍丁胺激活I1R具有拮抗吗啡正性强化作用及精神依赖的作用。以上结果提示,胍丁胺在小鼠的阿片精神依赖模型中具有一定的抗阿片成瘾效应,但不完全与大鼠的结果(胍丁胺抑制吗啡诱发大鼠行为敏化的形成)相一致,并且其是否通过I1R发挥作用,需在敲除小鼠中进行深入研究。综上所述,本研究发现特异性敲除I1R增强了阿片成瘾的敏感性,与胍丁胺激活I1R抗成瘾的作用相呼应;而神经元特异性敲除小鼠不影响自然奖赏效应,其基础痛阈减弱与胍丁胺激活I1R发挥弱的镇痛效应相一致;并且胍丁胺联合育亨宾用药在野生型小鼠中具有一定的抗阿片成瘾的作用。提示胍丁胺-I1咪唑啉受体可能构成了一个新的阿片功能调节系统,成为理想的抗阿片成瘾的药物靶标。