一点红萝卜中dsRNA病毒的研究

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双分病毒科病毒为双链RNA(dsRNA)病毒,包括双分病毒属,α-隐潜病毒属和β-隐潜病毒属,侵染植物和真菌,但对寄主不产生明显影响。双分病毒科内属的划分主要以病毒粒子形态、寄主范围、基因组dsRNA的大小以及血清学关系等为依据。随着病毒基因序列的大量测定,亟需把病毒基因组及蛋白的分子特征,以及病毒之间的进化关系作为双分病毒的分类依据。以病毒RdRp序列比对为基础,对双分病毒科成员进行的系统发生分析,结果表明,此科病毒聚类成两个大组--组A和组B,且每组包含两个亚组,分别为亚组I、II和亚组III、IV。每个大组均含有一个侵染植物的亚组和一个侵染真菌的亚组。病毒成员基因组,诸如碱基组成,功能蛋白的大小和核酸序列功能区域的保守性(5’末端非编码区)等分子特征,也支持此系统发生分析结果。据此,我们提议把双分病毒科划分为四个属:α-隐潜病毒属和β-隐潜病毒属,分别对应于亚组II和亚组III,它们的寄主主要为植物;α-双分病毒属和β-双分病毒属,分别对应于亚组I和亚组IV,主要寄主为真菌。   之前,我们在一点红萝卜(Raphanu.sativu.cv.Yidianhong)中分离到了两种种传的三分体的双分病毒。改进病毒检测方法、扩大检测范围后,又发现了三种具有类似传播特性的病毒。分析结果显示,一点红萝卜和圆白萝卜中的dsRNA主要分为三种类型,初步推测它们分别是三种侵染萝卜的病毒:1)一点红中大小约为150.bp左右的单.dsRNA,暂定名为RasV.ds.(Raphanu.sativusvirus.dsRNA):2)大小约为350.bp的两条大小相近的dsRNA,暂命名为RasV.ds.(Raphanu.sativu.viru dsRNA);3)存在于圆白萝卜中的大小约为150.bp的两条大小相近的dsRNA,暂定名为RasV.ds.(Raphanu.sativu.virus.dsRNA),RasV.dsR大小在这两条dsRNA之间。提取病毒粒子后,电镜观察显示:RasV3为直径约3.nm的球状病毒粒子;RasV4为直径约为3.nm的球状病毒粒子;RasV5也为球状病毒粒子,但有较为分明的棱角结构,且直径较大,约为4.nm。SDS-PAGE电泳分析,RasV4含有两条大小在5.kD的蛋白条带,且较大的条带浓度远高于较小的条带;RasV5同样含有两条蛋白条带,但一条在5.kD左右,一条在4.kD左右。RasV3的萝卜提取的病毒粒子未观察到明显的条带。RasV3克隆测序和分析结果显示,其基因组由两条大小相近的dsRNA组成(dsR1和dsR2),GenBank数据库的序列号分别为FJ461349和FJ4613509。dsR1长160.bp,ORF预测及序列比对分析后,推测其编码由481个氨基酸残基组成的病毒复制酶RdRp,分子量为54 kD. dsR2长158.bp,最大开放阅读框编码一个由374个氨基酸残基组成的蛋白,分子量为42 kD,未在GenBank中检索到相似序列,但是根据病毒基因组结构推测此蛋白为病毒的外壳蛋白。以dsR1编码的RdRp与其相似序列构建的系统发生树表明,RasV3聚类到双分病毒亚组III,即应归类到提议的β-隐潜病毒属。
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