论文部分内容阅读
目的：RNA干扰是一种由siRNA或dsRNA介导的基因沉默表达的方式。通过与靶mRNAde特异性结合,这些小RNA与Argonaute (AGO)蛋白及相关因子形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),后者完成对靶mRNA的剪切或者翻译抑制。前面通过酵母双杂交筛选出与人类Argonaute2 (Ago2)相关蛋白——DFFA和PSMC3,本实验在此基础上,进一步通过免疫共沉淀验证它们与Ago2相互作用的特异性,通过荧光实验,我们推测这两种蛋白在体内miRNA或者siRNA介导的mRNA剪切中发挥着重要功能。方法：利用免疫共沉淀的方法在细胞内验证DFFA、PSMC3同人类Ago2蛋白之间相互作用的特异性,通过GST pull-down验证DFFA同Argonaute2 PIWI结构域(hAgo2 PIWI)体外结合作用。构建内源性miR-21介导的GFP阳性Read-Out报告系统,通过该系统验证在分别敲除DFFA和PSMC3的情况下,被抑制的GFP表达效果是否得以增强；利用siRNA-GFP和表达GFP的质粒作为研究siRNA介导的GFP表达抑制,观察在分别敲除DFFA和PSMC3的情况下GFP的表达强度变化,间接推测两者在由小RNA介导的RNA干扰过程中的功能。结果：1.免疫共沉淀证实外源性DFFA和PSMC3同转染的hAgo2 PIWI存在着特异的相互作用。进一步的实验证明,DFFA和PSMC3 Flag融合蛋白的N端结构域可能与全长的hAgo2蛋白相互结合。2.通过GST-pull down体外结合实验证实DFFA同hAgo2 PIWI的相互作用。3.敲除了DFFA、PSMC3对miR-21介导的内源封闭报告系统产生的积极地作用。4.敲除了DFFA、PSMC3对si-GFP介导的GFP抑制产生了逆转的效果。结论：DFFA在体内、体外均同hAgo2 PIWI存在着相互作用,PSMC3在体内同hAgo2 PIWI存在着相互作用；DFFA和PSMC3 Flag融合蛋白的N端结构域可能与全长的hAgo2蛋白相互结合。敲除实验证实DFFA、PSMC3均参与了由miRNA或者siRNA介导的mRNA剪切过程,推测两者可能是新的RISC组件。