氧的利用和调节是高等生物生存的基本条件，低氧可参与或导致许多病理生理过程的改变及一些疾病的发生，如窒息、高原反应、缺血、脑中风、心肌梗死，以及癌细胞耐药和转移等。缺血/低氧预适应(Ischcmic/hypoxicpreconditioning，I/HPC)是一种内源性保护机制，即亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。脑I/HPC引起的保护机制为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤的策略提供了新思路。然而，目前关于脑I/HPC发生发展的细胞分子机制尚不清楚。以往的研究表明，在脑I/HPC发生发展过程中，蛋白激酶c(PKCs)βⅡ、γ和ε等亚型膜转位水平(激活程度)明显增高；在丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)家族的3个成员中，p38 MAPK发生了区域和细胞特异性激活，而细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化水平则显著降低。然而，作为MAPKs家族的另一个重要成员，c-Jun N-末端激酶(JNK)在脑I/HPC形成过程中的作用，以及广泛参与细胞内各种反应的PKCs，尤其是中枢神经系统特有的经典型PKC(cPKC)γ，与MAPKs三成员之间是否存在着直接的相互作用等问题，目前均未见报道。 据此，本研究拟通过观察HPC小鼠脑内JNK的磷酸化水平和蛋白表达量的变化，以及cPKCr与MAPKs特定亚型的相互作用情况，来进一步丰富人们对脑HPC信号转导机制的认识。 实验在室温20-22℃下进行，选用成年(12-14w，体重18-22g)雄性BALB/c小鼠，动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No．80-23)进行。将实验动物随机分为正常对照(HO)、重复性低氧暴露1～4(H1～H4，早期HPC)和5～6次(H5和H6，延迟性HPC)等7组，其中H5和H6组是部分H4组小鼠恢复24h后，再进行第5和6次低氧暴露。小鼠在低氧暴露结束后，迅速分离海马和大脑皮层组织。其中部分组织用于提取全细胞蛋白成分，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)等技术方法，观察了重复低氧刺激下，小鼠海马组织和大脑皮层内JNK第183位苏氨酸和第185位酪氨酸(Thrl83/Tyr185)位点的磷酸化水平及其蛋白表达量的变化。同时，应用免疫组织化学和免疫荧光等技术，进一步印证了Western blot实验结果，并明确了磷酸化JNK免疫反应阳性细胞的类型；另一部分组织用于提取胞浆和膜相关蛋白组分，应用免疫共沉淀(Co-IP)、Western blot、双向电泳(2DE)和银染等技术，对小鼠海马组织内与cPKCγ),相互作用的MAPKs家族特定成员，以及其它信号蛋白进行了初步的分析和鉴定。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理，并以均数±标准误(X±s．E．)表示，其中p<0.05为显著性差异。实验结果如下： 1.随着低氧暴露次数的增加，小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长。与H1组(17.8±0.6min)相比，H2(25.4±0.8min)、H3(30.8±0.9min)、H4(35.6±1.3min)、H5(21.8±0.5min)和H6(27.9±1.0min)组小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05，每组n=50)。小鼠低氧耐受时间的变化趋势表明，在早期HPC形成过程中，小鼠逐渐对低氧刺激产生耐受，经过三次低氧暴露(H3)后，小鼠对低氧的耐受时间较一次低氧暴露H1组增高一倍左右。然而，在此基础上再增加低氧暴露的次数，低氧耐受时间的增加则不明显。延迟性HPC组(H5和H6)小鼠的低氧耐受时间虽然明显高于H1组，但较H4组有明显回落。以上结果提示，本实验成功地制备了早期和晚期HPC小鼠模型。 2.HPC小鼠脑内JNK磷酸化水平(激活程度)和蛋白表达量的变化情况。 (1)HPC小鼠海马及皮层组织内JNK磷酸化水平明显升高：Western blot定量分析结果显示，在早期HPC(H1～H4)形成过程中，小鼠海马和大脑皮层组织内JNK的THr183/Tyr185位点磷酸化(hospho-Thrl83/Tyr185JNK)水平，随低氧暴露次数的增加而不断升高；同样，在延迟性HPC(H5和H6)形成过程中，小鼠海马和大脑皮层组织内phospho-Thr183/Tyr185 JNK水平也明显升高。统计学分析表明，上述早期和延迟性HPC鼠脑内JNK磷酸化水平的升高均具有显著的统计学差异(P<0.05，每组n=6)。为进一步证实Western blot的结果，我们选取正常对照HO组、代表早期HPC的低氧暴露3次(H3)和代表延迟性HPC的低氧暴露6次(H6)组小鼠脑组织，进行了免疫组织化学染色(DAB法)。结果表明，与HO组相比，H3和H6组小鼠海马及大脑皮层组织内phospho-Thr183/Tyr185 JNK免疫阳性细胞数明显增多(P<0.05，每组n=3)。本结果表明，JNK的Thr183/Tyr185位点磷酸化水平增高可能参与了小鼠脑HPC的发生发展过程。 (2)HPC小鼠海马及大脑皮层组织内JNK蛋白表达量无明显变化：Western blot定量分析结果显示，随低氧暴露次数的增加，无论是早期HPC(H1～H4)还是延迟性HPC(H5、H6)形成过程中，小鼠海马和大脑皮层组织内JNK蛋白表达量均没有发生显著变化。提示，JNK可能不以蛋白表达量的改变来参与脑HPC的发生发展过程。 (3)HPC小鼠海马及大脑皮层组织中JNK的激活主要发生在神经元内：为了进一步确定phospho-Thrl83/Tyr185 JNK免疫阳性细胞的类型，我们选取H3组小鼠脑片进行免疫荧光双标，来观察海马和大脑皮层组织内phospho-Thr183/Tyr185 JNK与神经元特异性标记物-神经颗粒素(neurogranin)的共定位情况。结果表明，在海马和大脑皮层组织内，phospho-Thrl83/Tyr185 JNK与神经颗粒素免疫阳性颗粒共定位在同一细胞上。提示，HPC小鼠海马及大脑皮层组织中JNK的激活主要发生在神经元内。 3.HPC小鼠脑组织内与ePKCγ相互作用蛋白的初步鉴定。 (1)小鼠海马组织内cPKCγ与ERK1/2可能存在着直接的相互作用：为确定cPKCγ与MAPKs特定成员间的相互作用情况，本实验首先选取H0、H3和H6组小鼠的海马组织，并借助cPKCγ的特异性抗体对其胞浆和膜相关成分进行免疫沉淀，来获得cPKCγ功能性免疫复合物。然后，利用SDS-PAGE对该蛋白复合物进行电泳分离后，分别用JNK、ERK1/2和p38 MAPK的总抗体或磷酸化抗体进行免疫印迹。结果显示，在46/54 kDa和38 kDa等处，H0、H3和H6小鼠海马组织内未见JNK和p38 MAPK的阳性条带。然而，无论是在H0、H3和H6小鼠海马组织的胞浆还是膜相关组分中，都可见到位于44/42 kDa的ERK1/2免疫阳性条带。表明，在正常或HPC鼠海马组织内，cPKCy与ERK1/2间存在着直接的相互作用。 (2)HPC小鼠海马组织内与cPKCγ：相互作用的ERK1/2磷酸化水平降低：Westernblot定量分析结果显示，与H0组相比，H3和H6组小鼠海马组织胞浆及膜相关成分中，与cPKCγ相互作用的ERK1/2的第204位酪氨酸位点磷酸化水平明显降低，并具有显著的统计学差异(P<0.05，每组n=4)。 (3)HPC小鼠海马组织内与cPKCγ相互作用的其它蛋白也发生了明显改变：首先应用cPKCγ的特异性抗体，对H0和H3组小鼠海马组织胞浆成分进行了免疫沉淀后，获得cPKCγ功能性免疫复合物。然后，用双向电泳对该蛋白复合物进行分离、银染，来寻找在脑HPC形成过程中与cPKCγ相互作用的其它已知或未知差异蛋白。结果显示，在cPKCγ功能性复合物中，H3组和H0组之间存在三处差异明显的蛋白点群。提示，与cPKCγ相互作用的信号转导复合物变化可能参与了脑HPC的发生发展过程。 综上所述，本研究发现，JNK在神经元内特异性激活增强，而非蛋白表达量改变，参与了脑HPC的发生发展过程；在此基础上，我们进一步发现cPKCγ与ERK1/2之间存在着相互作用，同时参与这种相互作用的ERK1/2磷酸化水平明显降低；此外，研究发现，与cPKCγ相互作用的其它蛋白也发生了明显改变。本研究所获成果不仅丰富了人们对脑HPC信号转导机制的认识，而且为后续分离、质谱鉴定和纯化与cPKCγ相互作用的已知或未知信号蛋白奠定了基础。同时，JNK、cPKCγ和ERK1/2等作为药物干预的合适靶分子，为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了一定的实验依据。