旋毛虫病(trichinellosis)是一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病,主要是因为生食或者半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉或其它动物肉类及肉制品所致。含有活的旋毛虫幼虫囊包的动物肉类被宿主食入之后,在消化酶的作用下,幼虫在胃中从囊包内逸出后钻入十二指肠及空场上段的肠粘膜中,经过一段时间发育后再返回肠腔。在感染30～40 h内,幼虫经4次蜕皮发育为成虫,新生幼虫于感染后4 d开始产出。产于肠粘膜内的新生幼虫能够侵入局部淋巴结或小静脉,然后随淋巴和血液循环到达各器官、组织或者体腔,但只有侵入横纹肌内的新生幼虫才能进一步发育。旋毛虫脱囊幼虫侵入小肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道中排出,是旋毛虫能否建立感染与致病的关键。由于不能在体外观察旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞或肠道排虫反应的过程,目前对幼虫侵入肠粘膜以及宿主排虫反应的机制均不完全清楚。　　 在旋毛虫感染的过程中,肌幼虫的排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原与表面抗原(surface antigens)直接暴露于宿主的免疫系统,是诱导宿主产生免疫应答的主要靶抗原,在幼虫的侵入与发育过程中可能具有重要作用。本文将旋毛虫感染性幼虫与HCT-8肠上皮细胞在体外共培养,观察旋毛虫幼虫ES抗原或表面抗原免疫鼠血清对幼虫侵入肠上皮细胞及发育的影响。同时对旋毛虫感染性幼虫及其ES抗原和表面抗原与人结直肠癌细胞系-8(human coloniccarcinoma cell line-8,HCT-8)在体外共培养后细胞蛋白的变化进行了研究。本文研究的目的是为了寻找旋毛虫侵入肠上皮细胞的相关因子。　　 材料与方法：　　 1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫(Trichinella spiralis),由本教研室昆明小鼠传代保种。健康6周龄雄性昆明小鼠、BALB/c小鼠,均购自河南省实验动物中心,所用细胞系为人结肠癌细胞系HCT-8细胞。　　 2.ES抗原与表面抗原免疫BABL/c血清的制备首次免疫将ES抗原与弗氏完全佐剂等体积混合后,分别采用皮下多点注射的方法免疫BALB/c小鼠；间隔10 d后再用等量ES抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合后免疫第2次；间隔10 d第3次免疫,方法同第2次免疫,于免疫后6 d尾静脉采血,分离血清,用ES抗原酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清抗体滴度,当抗体滴度达104以上时,于第3次免疫后10 d加强免疫1次,方法同第2次免疫,7 d后眶窦静脉采血,分离血清。表面抗原免疫血清的制备方法同ES抗原免疫血清,ES抗原与表面抗原每次免疫小鼠的剂量均为20μg/只。ELISA检测ES抗原、表面抗原免疫鼠血清抗体滴度。　　 3.旋毛虫肌幼虫的激活将新鲜的肌幼虫用含5％牛胆汁的无菌生理盐水在37℃5％CO2条件下孵育2 h,用无菌生理盐水洗涤3次后,在含抗生素的生理盐水(100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素)中37℃孵育1 h备用。　　 4.肌幼虫在肠上皮细胞单层中发育情况的观察将激活后肌幼虫悬浮在半固体培养基中后铺入培养的HCT-8细胞单层,37℃5％CO2条件下培养不同时间后在倒置显微镜下观察肌幼虫体外发育情况。　　 5.免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响将ES抗原或表面抗原免疫鼠血清与半固体培养基按1:10充分混合后,加入激活后的肌幼虫,然后覆盖到培养的HCT-8细胞表面,37℃5％CO2条件下培养不同时间观察旋毛虫幼虫的形态及发育。培养36 h后除去半固体培养基,收集肌幼虫,间接荧光抗体试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)观察旋毛虫幼虫蜕皮情况,计数1期及2～4期幼虫数。　　 6.HCT-8细胞与ES抗原或表面抗原孵育后IFA检测将ES抗原或表面抗原添加到培养基中,与HCT-8细胞共孵育2 h后,IFA检测细胞表面荧光情况,同时设立正常HCT-8细胞作为对照。　　 7.HCT-8细胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定将激活的肌幼虫和培养基按照5000条/ml比例混合后加到HCT-8细胞表面,37℃5％CO2条件下培养18 h后,PBS洗去肌幼虫,0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化收集HCT-8细胞后提取细胞蛋白,利用十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹(Western blot)进行分析。　　 结果：　　 1.肌幼虫在肠上皮细胞单层中的发育情况旋毛虫幼虫培养12 h时头尾端未见脱鞘；18 h在幼虫尾端可见鞘的形成；24 h可见幼虫部分蜕皮,但未蜕下完整表皮；36 h幼虫已蜕下一层完整的表皮；48 h可见旋毛虫幼虫第二层鞘的形成；72 h可见幼虫脱下2层完整的表皮；84 h可以看到旋毛虫幼虫包裹在3层鞘内；96 h可见到早期雄虫,在其尾端能够看到交配附器。　　 2.免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响旋毛虫幼虫在含ES抗原或表面抗原免疫血清的半固体培养基+HCT-8细胞培养15min后,发现ES免疫血清组的部分幼虫头端有帽样结构形成,旋毛虫感染小鼠血清对照组部分幼虫头端也有帽样结构；表面抗原免疫血清组、正常小鼠血清对照组的幼虫均未观察到帽样结构。在未加血清的半固体培养基+HCT-8细胞中培养的幼虫也未发现帽样结构。少数带有头端帽样结构的幼虫可移行到细胞单层,多数仍停留在半固体培养基中,但均不能侵入肠上皮细胞单层中。幼虫在含不同血清的半固体培养基+HCT-8细胞中发育至2-4期幼虫百分比的差异有统计学意义(x2=178.3,P<0.05),在含旋毛虫感染鼠血清、ES抗原及表面抗原免疫鼠血清条件下发育至2-4期幼虫的百分比分别为1.17％(1/86)、2.25％(2/89)、2.2％(3/91),均明显低于含正常鼠血清条件下培养的幼虫百分比为24.74％(22/97)(x12=77.6,x22=74.6,x32=66.9,P<0.05),但在感染鼠血清、ES抗原及表面抗原免疫鼠血清条件下发育至2-4期幼虫百分比的差异无统计学意义(x2=2.14,P>0.05)。　　 3.IFA观察ES抗原和表面抗原与HCT-8细胞的结合情况正常HCT-8细胞与ES抗原免疫血清、表面抗原免疫血清及旋毛虫感染鼠血清均为阳性反应,呈现绿色荧光,但与正常鼠血清为阴性反应。HCT-8细胞经ES抗原孵育后,与ES抗原免疫血清及旋毛虫感染鼠血清均为强阳性反应,呈现亮绿色荧光,与正常鼠血清仍为阴性反应；HCT-8细胞经表面抗原孵育后,与表面抗原免疫血清及旋毛虫感染鼠血清均为强阳性反应,与正常鼠血清仍为阴性反应。　　 4.HCT-8细胞与肌幼虫孵育后细胞蛋白的SDS-PAGE结果 SDS-PAGE结果表明,正常的HCT-8细胞有30条蛋白带,分别为131、118、108、104、96、90、85、80、74、72、68、66、61、57、53、48、46、45、43、39、37、34、32、29、28、25、24、21、20、15kDa。HCT-8细胞与幼虫孵育后的细胞蛋白增加了3条蛋白带,分别为38、36、17kDa,但减少了1条72kDa的蛋白带。　　 5.HCT-8细胞与幼虫孵育后细胞蛋白的Western blot分析结果Western blot结果显示,正常HCT-8细胞的蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有14条带,分别为131、90、68、53、48、46、45、44、39、34、32、29、25、23kDa,HCT-8细胞与肌幼虫孵育后的细胞蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有16条带,分别为131、90、68、66、61、57、53、48、46、45、39、34、32、29、25、17 kDa。HCT-8细胞与肌幼虫孵育后与正常细胞相比,被旋毛虫感染鼠血清多识别了4条蛋白带(66、61、57、17 kDa),少识别了2条蛋白带(44、23kDa)；正常HCT-8细胞蛋白能被表面抗原免疫血清识别的有6条带,分别为48、46、34、32、29、23kDa,HCT-8细胞与幼虫孵育后的细胞蛋白能被表面抗原免疫血清识别的也有6条带,分别为48、46、45、34、32、29kDa。HCT-8细胞与幼虫孵育后与正常细胞相比,被表面抗原免疫血清多识别了1条45kDa蛋白带,少识别了1条23kDa蛋白带；正常HCT-8细胞蛋白能够被ES抗原免疫血清识别的有3条带,分别为90、48、43kDa:细胞与幼虫孵育后的细胞蛋白能够被ES抗原免疫血清识别的有6条带,分别为90、45、43、34、21、17kDa。HCT-8细胞与幼虫孵育后与正常细胞相比,被ES抗原免疫血清多识别了4条蛋白带(45、34、21、17kDa),少识别了1条蛋白带(48kDa)。　　 结论：　　 1.旋毛虫ES抗原免疫血清可阻止部分幼虫对肠上皮细胞的侵入,ES抗原及表面抗原免疫血清均可阻止部分幼虫的发育(蜕皮)。　　 2.HCT-8细胞与幼虫孵育后被旋毛虫感染鼠血清及免疫血清多识别出的7种蛋白(66、61、57、45、34、21、17 kDa)可能是幼虫侵入肠上皮细胞的相关因子；少识别出的3种蛋白(48、44、23kDa)可能是HCT-8细胞释放出的特异性介质。