腺病毒介导的淋巴细胞趋化因子对白细胞介素-10基因修饰的EG7的治疗作用及其相关机制

来源 :浙江大学医学院 浙江大学医学部 浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shinemun
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研究表明恶性肿瘤生长迅速的一个重要机制是肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。肿瘤细胞在体内生长的同时,自身也可分泌多种抑制免疫活性的物质,如白介素-6、白介素-10、转化生长因子-β,抑制免疫细胞的应答,促进肿瘤细胞的生长,逃避机体免疫系统的监视。因此,利用细胞因子优化肿瘤抗原提呈的微环境,解除肿瘤细胞对其周围免疫细胞的抑制作用,活化免疫细胞的特异性抗肿瘤免疫应答功能,是抑制肿瘤细胞逃逸机体免疫监视的一个重要措施。 白介素-10(IL-10)被普遍认为是一种免疫抑制性细胞因子,促使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视,但近年对肿瘤免疫的研究方向部分倾向于IL-10的免疫刺激功能。实际上,在不同的肿瘤模型中,IL-10对天然性、适应性免疫具有正反双重调节作用,它能使肿瘤细胞逃避机体抗肿瘤效应,亦可作为一种免疫佐剂增强机体抗肿瘤免疫应答。有研究发现将IL-10基因转染入肿瘤细胞中,局部高表达的IL-10使肿瘤细胞丧失成瘤性并增强免疫原性,从而有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应,如IL-10基因修饰的肿瘤细胞建造的动物模型,黑色素瘤、CT26结肠癌、乳腺肿瘤、Burkitt淋巴瘤等的致瘤性降低,抑制程度与IL-10的分泌量呈正相关,远处转移能力丧失,并最终引起肿瘤消除。 EG7是来源于C57BL/6的T淋巴瘤细胞EL-4稳定表达OVA的肿瘤细胞株,将mIL-10基因转染EG7细胞制备成稳定表达IL-10的EG7/IL-10细胞株。C57BL/6小鼠皮下接种EG7/IL-10细胞,建立小鼠T淋巴瘤模型,使小鼠T淋巴瘤局部微环境高表达IL-10,观察小鼠体内成瘤情况以及荷瘤小鼠的免疫功能,在先前对IL-10基因修饰肿瘤细胞研究基础上进一步探讨IL-10抗肿瘤机制,尤其是非特异性增强NK细胞杀伤活性。单独应用一些具有抗肿瘤作用的细胞因子如IL-10、IL-12、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等进行基因治疗虽然能有效地诱导抗肿瘤效应,但它们的效果比较局限,一般只能在一定程度上局部抑制肿瘤的生长,对于已经恶性生长的肿瘤,这种单独细胞因子基因疗法很难达到理想的效果。选择相互间有协同免疫调节作用和抗肿瘤作用的细胞因子,进行联合基因治疗,是肿瘤细胞因子基因治疗的一个发展方向。 实验表明,淋巴细胞趋化因子(Lptn)可特异性趋化自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和T细胞至肿瘤发生部位,杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤生长。Dilloo等报道在小鼠肿瘤模型中,Lptn与IL-2联合具有抗肿瘤活性,Lptn可吸引肿瘤局部的T细胞、NK细胞浸润,而IL-2使T细胞大量扩增。从而提高特异性的抗肿瘤免疫应答。以树突状细胞为基础的疫苗,可通过提高树突状细胞的抗原提呈能力激发起抗原特异的细胞毒性T细胞(CTE)反应。 鉴于Lptn可有效趋化NK和T细胞,我们将联合Ad-Lptn瘤内注射治疗转染IL-10的EG7 T淋巴瘤。本课题主要目的是研究IL-10基因修饰的EG7 T淋巴瘤的致瘤性及对荷瘤小鼠免疫功能影响,同时通过瘤内注射Ad-Lptn联合治疗小鼠T淋巴瘤,观察其对小鼠T淋巴瘤的治疗作用以及长期免疫保护作用,为抗肿瘤治疗新方法提供实验依据。建立了稳定表达IL-10的小鼠T淋巴瘤模型EG7,对小鼠肿瘤生长、生存期做了进一步观察,应用Lptn的重组腺病毒进行瘤内注射观察其治疗效果。 第一部分:IL-10基因修饰对EG7致瘤性的影响 收集对数生长期的EG7、EG7/IL-10细胞,注射至C57BL/6小鼠右大腿外侧,建立T淋巴瘤模型,用游标卡尺测量肿瘤大小并观察荷瘤小鼠的生存期,详细记录小鼠肿瘤生长大小、速度及健康状况。结果发现,与EG7对照组相比,IL-10基因修饰的EG7抑制了肿瘤的生长,延长了荷瘤小鼠的生存期。研究发现,高表达的IL-10增强了小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性并诱导了更多的Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的分泌。提示机体被有效诱导产生了特异性和非特异性的抗肿瘤免疫反应。 第二部分:Ad—Lptn瘤内注射增强IL-10基因修饰的EG7的抗肿瘤作用 收集对数生长期的EG7、EG7/IL-10细胞,注射至C57BL/6小鼠右大腿外侧,建立T淋巴瘤模型,随机分组后,分别瘤内注射腺病毒Ad-Lptn进行治疗,并设PBS和Ad-lacZ为对照组,并测量肿瘤大小及观察荷瘤小鼠的生存期。结果发现,与EG7对照组相比,IL-10基因修饰的EG7致瘤性降低,肿瘤生长缓慢;与PBS和Ad-LacZ对照组相比,联合Ad-Lptn进行治疗,不仅显著抑制了肿瘤的生长,而且促进了肿瘤的消退,延长了荷瘤小鼠的生存期,尤其是IL-10基因修饰的肿瘤。机制研究发现,瘤内高表达的IL-10增强了小鼠的NK和CTL杀伤活性,提示机体被有效诱导产生了特异性和非特异性的抗肿瘤免疫反应;联合Ad-Lptn治疗更显著增强了小鼠的NK和CTL杀伤活性并诱导了更多的Fh1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌。 进一步用半定量RT-PCR的方法检测了肿瘤组织中IP-10、Mig、VEGF和MMP-2的表达情况。结果发现,IP-10和Mig可表达在转染IL-10的肿瘤组织和Ad-Lptn瘤内治疗组,而未转染IL-10的EG7组及其PBS、Ad-Lacz治疗组则无表达;血管内皮生长因子(VEGF)和间质金属蛋白酶-2(MMP-2)在转染IL-10的肿瘤组织和Ad-Lptn瘤内治疗组的表达量较低,而未转染IL-10的EG7组及其PBS、Ad-Lacz治疗组则高表达。提示肿瘤微环境中IL-10和Lptn可能通过诱导肿瘤组织表达更多的干扰素诱导蛋-10(IP-10)和干扰素诱导单核因子(Mig),减少VEGF和MMP-2的表达,从而发挥其抑制肿瘤血管形成的抗肿瘤作用。 肿瘤组织“VEGF免疫组化和HE染色的结果与上述结论一致,结果显示,与对照组相比,高表达IL-10组和Ad-Lptn治疗组瘤内VEGF蛋白表达降低,瘤组织坏死明显。提示肿瘤微环境中IL-10和Lptn可能抑制了肿瘤血管生成,致使肿瘤组织缺血坏死,坏死的肿瘤组织更有利于机体对肿瘤的清除。 第三部分:CD4+ T、CD8+ T、NK细胞亚群剔除实验 EG7T淋巴瘤生长迅速,恶性程度高,短时间内就能导致荷瘤小鼠死亡。通过腹腔注射抗CD4、抗CD8或抗NK1.1单克隆抗体,分别剔除CD4+ T、CD8+ T或NK细胞,并设大鼠IgG为阴性对照组。剔除效率经流式细胞术检测,结果表明在小鼠外周血和脾脏中>95%的CD4+T、CD8+T、NK细胞被成功剔除。在各种免疫细胞亚群剔除的C57BL/6小鼠中,观察了Ad-Lptn对EG7及IL-10基因转染的EG7 T淋巴瘤的治疗效果。结果表明CD4+T、CD8+T及NK细胞在Ad-Lptn和/或IL-10抗肿瘤效应中均发挥了重要的作用,其中以CD8+T为主。 结论: 1.与EG7相比,IL-10基因修饰的EG7 T淋巴瘤生长缓慢,肿块较小,其机制与IL-10增强了荷瘤小鼠NK、CTL杀伤活性、诱导机体产生了特异性和非特异性的抗肿瘤免疫应答相关。 2.接受Ad-Lptn瘤内注射治疗的荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,肿块较小,机制为Lptn更进一步增强了小鼠的NK和CTL杀伤活性,并诱导了更多的Th1型细胞因子(IL-2,IFN—γ)的分泌。此外,促进瘤内IP-10和Mig肿瘤血管抑制因子高表达,VEGF和MMP-2低表达,抑制了新生肿瘤血管形成。 3.免疫效应细胞剔除实验证实,在Ad-Lptn瘤内注射治疗EG7及IL-10基因修饰的EG7 T淋巴瘤模型中,CD4+T、CD8+T和NK细胞在Ad-Lptn和/或IL-10抗肿瘤效应中均发挥了重要的作用,其中以CD8+T为主。
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